Зміни кальцієвого гомеостазу в нейронах культури гіпокампа щурів при інкубації з в-амілоїдом - Автореферат

Основними нейропаталогічними характеристиками хвороби Альцгеймера є наявність у мозку хворих характерних нейрофібрилярних філаментів (утворених з патологічно видозміненого тау-білка, що входить до складу цитоскелета) та сенільних бляшок, основним структурним компонентом яких є білок в-амілоїд. в-Амілоїд являє собою пептид розміром 42 амінокислотних залишків (Pearson, 2006), який продукується при розщепленні доволі великого мембранного білка - білка-попередника амілоїду (amyloid precursor protein - APP). Експериментально було показано, що при хворобі Альцгеймера збільшується концентрація довших молекул амілоїдів, а саме молекул з 42 амінокислотними залишками (Glabe and Kayed, 2006). Було виявлено, що в-амілоїд, присутній у надлишкових кількостях, може проявляти в мозку нейротоксичні властивості та призводити до порушення кальцієвого гомеостазу: викликати продукування великої кількості вільних радикалів, збільшувати кількість активних форм кисню, призводити до пошкодження дендритів нервових клітин, індукувати апоптоз та некроз нейронів. Отже, дослідження зміни кальцієвого гомеостазу та функціонування внутрішньоклітинних кальційрегулюючих структур нейронів центральної нервової системи при впливі амілоїду являє безсумнівний науковий інтерес та може розширити розуміння молекулярних механізмів виникнення та розвитку хвороби Альцгеймера, а також слугувати для пошуку фармакологічних засобів для лікування та можливого запобігання цієї патології. Для її здійснення були поставлені наступні завдання: · за допомогою методу двохвильового вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію з використанням мембранопроникної форми флуоресцентного барвника fura-2 виявити можливий вплив білка в-амілоїду на цитоплазматичну концентрацію кальцію в спокої в нейронах культури гіпокампа;В наших експериментах модель хвороби Альцгеймера одержували внаслідок додавання концентрованого розчину в-амілоїду до культурального середовища в кінцевій концентрації 2 МКМ за 24 години до експериментів по вимірюванню внутрішньоклітинної концентрації кальцію ([Ca2 ]і) та реєстрації струмів у нейронах культури гіпокампа. Для кількісного визначення концентрації кальцію в нейронах культури гіпокампа використовували мембранопроникну форму барвника fura-2 (fura-2/AM). Знаючи відносну зміну інтенсивності флуоресценції при збудженні двома довжинами хвиль, можна розрахувати [Са2 ]і в клітині за наступною формулою, яка була запропонована Грінкевичем та співавторами в 1985 (Grynkiewicz et al., 1985): [Ca2 ]i=Kd*b*(R-Rmin)/(Rmax-R) [1] де Kd - константа дисоціації комплексу fura-2 з кальцієм, R = F360/F390 - поточне співвідношення флуоресцентних сигналів, Rmin = F360/F390| Ca0 - те ж відношення в розчині з низькою концентрацією Са2 , Rmax=F360/F390|Ca? - те ж відношення в розчині з високою концентрацією Са2 , b = F390|Ca0/F390|Ca? - відношення флуоресцентних сигналів у розчинах з низькою та високою концентраціями Са2 при збудженні довжиною хвилі 390 нм. За допомогою методу двохвильової кальційметрії було встановлено, що рівень базової концентрації кальцію в нейронах культури гіпокампа щурів за умов 24-годинної інкубації з в1-42-амілоїдом був достовірно підвищеним порівняно з контролем та складав 138 ± 12 НМ (p <0.01, n = 19). Суттєва різниця в характеристиках кальцієвих транзієнтів, викликаних при деполяризації клітини гіперкалієвим розчином, в нейронах культури гіпокампа в контролі та за умов попередньої інкубації з в-амілоїдом, була виявлена при аналізі кінетики їх спаду, яка характеризує виведення Са2 з цитоплазми клітини.В дисертаційній роботі за допомогою методу двохвильового вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію з використанням мембранопроникної форми флуоресцентного барвника fura-2/AM та методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” на експериментальній моделі хвороби Альцгеймера було встановлено порушення кальцієвого гомеостазу та кальційрегулюючих структур нейронів культури гіпокампа щурів. Інкубація нейронів культури гіпокампа щурів протягом доби з пептидом в1-42-амілоїдом призводить до статистично достовірного підвищення базового рівня [Са2 ]і порівняно з відповідним показником в контрольних клітинах. При інкубації клітин гіпокампа з в1-42-амілоїдом виявлено статистично достовірне збільшення площі, амплітуди та часу напівспаду кальцієвих транзієнтів нейронів культури гіпокампа, викликаних гіперкалієвою деполяризацією, порівняно з відповідними контрольними значеннями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В дисертаційній роботі за допомогою методу двохвильового вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію з використанням мембранопроникної форми флуоресцентного барвника fura-2/AM та методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” на експериментальній моделі хвороби Альцгеймера було встановлено порушення кальцієвого гомеостазу та кальційрегулюючих структур нейронів культури гіпокампа щурів.

1. Інкубація нейронів культури гіпокампа щурів протягом доби з пептидом в1-42-амілоїдом призводить до статистично достовірного підвищення базового рівня [Са2 ]і порівняно з відповідним показником в контрольних клітинах.

2. При інкубації клітин гіпокампа з в1-42-амілоїдом виявлено статистично достовірне збільшення площі, амплітуди та часу напівспаду кальцієвих транзієнтів нейронів культури гіпокампа, викликаних гіперкалієвою деполяризацією, порівняно з відповідними контрольними значеннями.

3. в1-42-Амілоїд призводить до достовірного збільшення густини інтегрального струму через потенціалкеровані кальцієві канали клітин культури гіпокампа на 70% порівняно з контрольним значенням.

4. При оцінці кінетичних характеристик потенціалкерованих кальцієвих каналів було встановлено, що крива стаціонарної активації зсунулась в напрямку гіперполяризації порівняно з відповідною кривою в контрольних умовах на 12 МВ. При дослідженні кривої стаціонарної інактивації кальцієвих каналів клітин культури гіпокампа статистично достовірної різниці виявлено не було.

5. При порівнянні Са2 транзієнтів, викликаних прикладанням гіперкалієвого розчину та гіперкалієвого розчину в присутності мітохондріального протонофора СССР, показано статистично достовірну різницю між амплітудами таких транзієнтів клітин культури гіпокампа в контрольних умовах. Після інкубації з в1-42-амілоїдом різниці між амплітудами кальцієвих транзієнтів не спостерігалось, що вказує на порушення функціонування уніпоретра мітохондрій.

6. Проведене дослідження систем кальцієвої сигналізації нейронів культури гіпокампа за умов інкубації з в1-42-амілоїдом вказує на їх комплексне порушення, що стосується як механізмів входу Са2 через канальні структури плазматичної мембрани, так і механізмів акумуляції Са2 цитоплазматичними структурами, в першу чергу мітохондріями. Цей комплекс порушень може бути істотним компонентом патологічних змін функцій гіпокампа при хворобі Альцгеймера.

1. Порушення кальцієвого гомеостазу при хворобі Альцгеймера / Т. Ю. Король, С. В. Король, О. П. Костюк, П. Г. Костюк // Neurophysiology. - 2008. - Т. 40, № 5/6. - С. 457-464.

2. Зміни кальцієвого гомеостазу в культивованих нейронах гіпокампа, викликані впливом в-амілоїду / Т. Ю. Король, С. В. Король, О. П. Костюк, П. Г. Костюк // Neurophysiology. - 2008. - Т. 40, №1. - С. 9-12. (Самостійно виконано експериментальну частину та підготовлено матеріали до друку).

3. Король Т. Ю. Вплив білка в-амілоїду на кальцієві канали плазматичної мембрани культивованих нейронів гіпокампа / Т. Ю. Король, О. П. Костюк, П. Г. Костюк // Фізіологічний журнал. - 2009. - Т. 55, № 4, - С. 10-16. (Здобувачем самостійно виконано частину експериментального матеріалу та підготовлено статтю до друку).

4. Король Т. Ю. Ушкодження кальційзахоплюючої функції мітохондрій при експериментальній хворобі Альцгеймера / Тетяна Король, Олена Костюк // Доповіді НАН України. - 2009. - № 6. - С. 186-190. (Самостійно проведено експериментальну частину та підготовлено статтю до друку).

Тези доповідей: 1. в-amyloid peptide induces changes in calcium signalling in hippocampal cells / T. Korol, S. Korol, O. P. Kostyuk, P. G. Kostyuk. // Acta Physiologica. - 2007. - V. 191, suppl. 658. - P. 69.

2. Store-operated calcium entry in sensory DRG neurons / S. Korol, T. Korol, O. P. Kostyuk, P. G. Kostyuk. // Acta Physiologica. - 2007. - V. 191, suppl. 658. - P. 56.

3. Capacitative calcium entry induced by activation of ryanodine receptors of endoplasmic reticulum in rat DRG neurons / S. V. Korol, T. Yu. Korol, O. P. Kostyuk, P. G. Kostyuk. // Фізіологічний журнал. - 2008. - Т. 54, № 2. - С. 116-117.