Зміни кальцієвoї сигналізації у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів при діабетичній нейропатії - Автореферат

Крім того, зміни кальцієвої сигналізації у первинних сенсорних нейронах за умов стрептозотоцин - індукованого діабету супроводжуються зменшенням кальцій-акумулюючої функції мітохондрій, параметрів викликаного деполяризацією кальцієвого сигналу та швидкості проведення больового імпульсу (Kostyuk E. et al. Враховуючи сказане, не викликає сумнівів високе теоретичне і практичне значення вивчення механізмів розвитку та корекції порушень кальцієвої сигналізації при діабетичних нейропатіях у нейронах дорзального рогу спинного мозку, як однієї з ланок у ланцюгу проведення больової інформації. Виявити наявність сенсорних полінейропатій та зміни Ca2 сигналізації у вторинних сенсорних нейронах дорзального рога спинного мозку у щурів зі стрептозотоцин-індукованим діабетом. Встановити внесок різних типів потенціалкерованих Ca2 каналів у генерацію, викликаних деполяризацією, [Ca2 ]i транзиєнтів та його зміни за умов стрептозотоцин - індукованого діабету. Також вперше було виявлено зміни внеску різних типів потенціалкерованих Ca2 каналів у генерацію, викликаних деполяризацією [Ca2 ]i транзиєнтів у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів за умов стрептозотоцин-індукованого діабету.Характер розвитку даної реакції був достовірно відрізнявся у контрольних та діабетичних тварин. В ході досліджень [Ca2 ]i у вторинних ноцицептивних нейронах, розташованих в ділянках ламіни I та substantia gelatinosa дорзального рога спинного мозку, не було виявлено істотної відмінності рівня базального кальцію в контрольних та діабетичних тварин. Рівень залишкового [Ca2 ]i, який реєстрували на 90-й с. після початку деполяризації, був достовірно вищим у діабетичних тварин та складав (у відсотках від піка викликаного деполяризацією Ca2 транзиєнта) 14.1 ± 1.2% (n = 25) порівняно з 2.8 ± 0.5% (n = 25) у контрольних тварин(р<0.001). Амплітуда, викликаних деполяризацією [Ca2 ]i транзиєнтів, яка не відрізнялась у контрольних та діабетичних тварин, під час дії 50 МКМ ніфедіпіну (блокатора L-типу Ca2 каналів) зменшувалась на 31 ± 5% (n = 18) та на 65 ± 3% (n = 13) у нейронах контрольних та діабетичних щурів відповідно. Дія 1 МКМ w-конотоксину викликала зменшення амплітуди [Ca2 ]i транзиентів, викликаних деполяризацією мембрани клітин на 23 ± 4% (n=8) у нейронах контрольних тварин, у той час як у нейронах щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом зменшення було достовірно більшим - 40 ± 3% (n=11).Динаміка змін больової реакції в діабетичних тварин, на відміну від контрольних, мала чітко виражений двофазний характер. В експериментах, проведених з використанням методу "гарячої поверхні", встановлено, що температурний больовий поріг не відрізнявся для контрольних та діабетичних тварин та складав 42°С, що свідчить про відсутність у діабетичних тварин температурної аллодінії. При порівнянні [Ca2 ]i транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в клітинах дорзального рога спинного мозку, не виявлено достовірної різниці між контрольними та діабетичними тваринами в базальному рівні [Ca2 ]i, в амплітуді транзиєнтів, викликаних деполяризацією, а також у швидкості наростання Ca2 сигналу. Одначе виявлені достовірні відмінності рівня залишкового Ca2 , який складав 2.8±0.5% та 14.1±1.2% від амплітуди транзиєнтів, викликаних деполяризацією для контрольних та діабетичних тварин відповідно. Фармакологічне дослідження внеску потенціалкерованих Ca2 каналів у генерацію Ca2 транзиєнтів, викликаних деполяризацією, показало, що їх внесок відрізняється у контрольних та діабетичних тварин.

Вимірювання змін больової чутливості. Формаліновий тест. Ноцицептивний стимул створювали підшкірним введенням 20 мкл 5% розчину формаліну в задню кінцівку тварини. Як основні больові реакцій було вибрано реакцію посмикування травмованої кінцівки та її лизання. Після введення формаліну, як у хворих, так і в контрольних щурів розвивалася реакція самочинного посмикування лапки, в яку був введений формалін. При цьому характер розвитку даної реакції достовірно відрізнявся у контрольних щурів та у щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом. У діабетичних тварин спостерігався яскраво виражений двофазний характер відповіді, яка складалася з першої "гострої" фази, тривалістю близько 10 хв., та другої "тонічної" фази перебіг якої, відбувався без яскраво виражених максимумів та припинявся до 85-90 хв. У контрольних тварин спостерігалася практично повна відсутність першої фази, а друга "тонічна" фаза, навпаки, була більш вираженою з одним максимумом на 40-45 хв. Експеримент проведений на 7 контрольних та 5 діабетичних тваринах. Друга больова реакція - лизання вколотої кінцівки, також характерна при виникненні больового рефлексу. Характер розвитку даної реакції був достовірно відрізнявся у контрольних та діабетичних тварин. Лизання лапки в діабетичних щурів теж мало яскраво виражений двофазний характер: перша "гостра" фаза тривалістю 10-15 хв. та друга "тонічна" фаза під час якої було зареєстровано появу локальних максимумів на 25-й, 60-й і 85-й хв. Експеримент проведений на 10 контрольних та 5 діабетичних щурах.

Метод "гаряча поверхня". Дана методика дозволяє оцінити два параметри змін больових поведінкових реакцій щурів. Перший - поріг чутливості до дії больового стимулу, другий - час реакції у відповідь на больовий стимул. Для створення ноцицептивного стимулу експериментальних тварин поміщали на поверхню розігріту до температури здатної викликати больову реакцію. Проявом больової реакції вважали лизання кінцівок, дотичних до нагрітої поверхні. У випадку, коли такої реакції не виникало протягом 10 хв., ми вважали, що дана температура є підпороговою. Було встановлено, що поріг больової чутливості для контрольних та діабетичних щурів не відрізнявся та складав 42°С. При підвищенні температури поверхні від 43 до 47°С не спостерігалося достовірних відмінностей у швидкості больової реакції у тварин, однак уже при 48°С, ці розбіжності досягали достовірності. Так у щурів, яких поміщали на гарячу поверхню з температурою 48°C, час появи больової реакції достовірно відрізнявся та складав 10 ±0.8 с (n=5) і 22 ± 1.5 с (n = 5), р < 0.001.

Зміни кальцієвої сигналізації в ноцицептивних нейронах за умов стрептозотоцин-індукованого діабету. Характер змін кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією. В ході досліджень [Ca2 ]i у вторинних ноцицептивних нейронах, розташованих в ділянках ламіни I та substantia gelatinosa дорзального рога спинного мозку, не було виявлено істотної відмінності рівня базального кальцію в контрольних та діабетичних тварин. Деполяризацію клітин викликали аплікацією гіперкалієвого розчину з концентрацією іонів К - 50 ММ. Істотної різниці значень пікових амплітуд та часу наростання кальцієвих транзиєнтів, викликаних деполяризацією, у контрольних та діабетичних тварин виявлено не було. Основна відмінність в характеристиці деполяризаційних [Ca2 ]i транзиєнтів у нейронах дорзального рога спинного мозку була виявлена при дослідженні кінетики їх спаду. Рівень залишкового [Ca2 ]i, який реєстрували на 90-й с. після початку деполяризації, був достовірно вищим у діабетичних тварин та складав (у відсотках від піка викликаного деполяризацією Ca2 транзиєнта) 14.1 ± 1.2% (n = 25) порівняно з 2.8 ± 0.5% (n = 25) у контрольних тварин(р<0.001).

Зміни внеску різних типів Са2 каналів плазматичної мембрани в генерацію [Ca2 ]i транзиентов за умов стрептозотоцин-індукованого діабету. Ефект ніфедіпіну. Амплітуда, викликаних деполяризацією [Ca2 ]i транзиєнтів, яка не відрізнялась у контрольних та діабетичних тварин, під час дії 50 МКМ ніфедіпіну (блокатора L-типу Ca2 каналів) зменшувалась на 31 ± 5% (n = 18) та на 65 ± 3% (n = 13) у нейронах контрольних та діабетичних щурів відповідно. Різниця між ефектами ніфедіпіну була достовірною (p<0.001).

Ефект w-конотоксину. Для визначення змін внеску потенціал керованих кальцієвих каналів у генерацію, викликаних деполяризацією [Ca2 ]i транзиєнтів, ми використовували специфічний блокатор N-типу високопорогових Ca2 каналів - w-конотоксин GVIA. Дія 1 МКМ w-конотоксину викликала зменшення амплітуди [Ca2 ]i транзиентів, викликаних деполяризацією мембрани клітин на 23 ± 4% (n=8) у нейронах контрольних тварин, у той час як у нейронах щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом зменшення було достовірно більшим - 40 ± 3% (n=11). Різниця між ефектами w-конотоксину була достовірною (p<0.01).

Сумісна дія нифедипину та w-конотоксину. Для перевірки, чи відрізняються мішені дії цих блокаторов, ми використовували сумісне додавання нифедипину та w-конотоксину. Сумісна дія 1 МКМ w-конотоксину та 50 МКМ ніфедіпіну супроводжувалась зменшенням амплітуди [Ca2 ]i транзиентів, викликаних деполяризацією мембрани клітин, на 52 ± 5% (n=8) у нейронах контрольних тварин, у той час як у нейронах щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом дане зменшення складало 78 ± 8% (n=8). Різниця між ефектами w-конотоксину була достовірною (p<0.01, Рис.4).

Ефект іонів нікелю. Іони нікелю використовувалися як блокатор низькопорогових Ca2 каналів Т типу. Іони нікелю викликали недостовірне зменшення амплітуди [Ca2 ]i транзиєнтів, викликаних деполяризацією як у контрольних так і у діабетичних тварин. Гістограма, яка відображає дію блокаторів різних типів кальцієвих каналів та зміни їх дії за умов експериментально-викликаного діабету.

Зміни функціонування мітохондрій. Для дослідження ролі мітохондрій у кальцієвій сигналізації ми використовували розєднувач протонного градієнта на внутрішній мембрані мітохондрій, що призводить до припинення захоплення [Ca2 ]i мітохондріями - карбоніл-цианід-м-хлорофеніл гідрозон (СССР), у концентрації 10 МКМ. Амплітуда, викликаних деполяризацією [Ca2 ]i транзиєнтів у нейронах дорзального рога спинного мозку при додаванні СССР у концентрації 10 МКМ складала 1249 ± 69 НМ (n = 22) у контрольних тварин та 827 ± 45 НМ (n = 22) за умов експериментального діабету. Різниця між амплітудами [Ca2 ]i транзиєнтів була статистично достовірною (p < 0.001).

Зміни у функціонуванні кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму. Ріанодин-чутливе депо Ca2 . Для вивчення роботи ріанодин-чутливого депо, ми використовували кофеїн, що знижує поріг активації ріанодинового рецептора кальцієм до рівня, якого достатньо щоб базальний [Ca2 ]i викликав його активацію та наступне вивільнення Ca2 з депо. Амплітуда [Ca2 ]i транзиєнтів, викликаних аплікацією 30 ММ кофеїну, була достовірно меншою в нейронах діабетичних тварин - 41 ± 8 НМ (n = 13), ніж у контрольних нейронах - 268 ± 18 НМ (n = 17). Різниця в між амплітудами була статистично достовірною (р < 0.001).

Ins3 - чутливе депо Ca2 . Сучасні дослідження показали що, як для глутамата, так і для АТФ існують відповідні метаботропні рецептори, активація яких призводить до вивільнення Ca2 з депо ЕР через інозитолтрифосфатний шлях. Додавання 200 МКМ АТФ до безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину призводило до транзиєнтного збільшення [Ca2 ]i у 59% нейронів, які були чутливими до дії АТФ у фізіологічному розчині (45 нейронів із 76). Одначе, з огляду на те, що експерименти проводили на тонких зрізах спинного мозку, ефект АТФ може бути замаскований вивільнення глутамата з, оточуючих нейрони, гліальних клітин (Idestrup C. 1998, Salter M. 1995). З метою виключити можливий вплив глутамата, ми використовували позаклітинний розчин, який містив блокатори різноманітних глутаматних рецепторів (100 МКМ AIDA - блокатор метаботропних глутаматних рецепторів MGLU1, MGLU5; 30 МКМ D-AP5 - блокатор іонотропних глутаматних рецепторів NMDA типу та 10 МКМ CNQX - блокатор інотропних глутаматних рецепторів AMPA типу). Додавання 200 МКМ АТФ у бескальциєвий розчин, який містив AIDA, CNQX і D-APV, супроводжувалось транзиєнтним збільшенням [Ca2 ]i в нейронах дорзального рога спинного мозку. Причому, це збільшення не відрізнялося достовірно від збільшення, що спостерігається, без додавання вищевказаних речовин у безкальцієвий позаклітинний розчин (n = 8, Рис. 5Б). Таким чином, одержані нами результати свідчать про можливість використання аплікації АТФ, як адекватного функціонального тесту

INSP3-чутливого шляху вивільнення Ca2 з депо ЕР. Амплітуда [Ca2 ]i транзиєнтів викликаних дією 200 МКМ АТФ у фізіологічному розчині складала 237 ± 24 НМ (n = 30) у нейронах контрольних тварин та 226 ± 23 НМ (n = 17) у нейронах щурів із СТЗ-індукованим діабетом, різниця між амплітудами не була статистично достовірною (Рис. 6). При додаванні АТФ до безкальцієвого розчину спостерігалось достовірне зменшення амплітуди кальцієвих транзиєнтів від 156 ± 14 НМ (n = 45) за контрольних умов до 104 ± 6 НМ (n = 21) за умов експериментального діабету (Рис. 6). Зменшення амплітуди АТФ-індукованих [Ca2 ]i транзиєнтів у безкальцієвому розчині складало 34 ± 6 % (n = 17) у нейронах контрольних тварин порівняно з нейронами щурів з експериментальним діабетом (p<0.01). Аналогічні експерименти були проведені для вивчення дії глутамата на іонотропні та метаботропні рецептори в контрольні та за умов експериментально-викликаного діабету. Амплітуда [Ca2 ]i транзиентів, викликаних дією 100 МКМ глутамата в фізіологічному розчині, складала 216 ± 19 НМ (n = 14) у нейронах контрольних тварин та 145 ± 20 НМ (n = 7) у нейронах діабетичних щурів. Аплікація глутамата в безкальцієвому розчині супроводжувалась достовірним зменшенням амплітуди кальцієвих транзиєнтів від 176 ± 21 НМ (n = 13) за контрольних умов до 80 ± 15 НМ (n=9) за умов експериментально-викликаного діабету. Амплітуда Ca2 транзиєнтів, викликаних глутаматом у безкальціевому розчині зменшувалась на 54 ± 6 % (n = 17) у діабетичних тварин порівняно з контрольними (p<0.01).

Ефект іономіцину. Для дослідження ємності Ca2 депо ЕР, ми використовували антибіотик іономіцин. Іономіцин у концентраціях менших чи рівних 1 МКМ призводить до вивільнення Ca2 з обох типів депо ЕР за ріанодин та INSP3 незалежним механізмом (Albert P. 1986). Амплітуда [Ca2 ]i транзиєнтів викликаних дією 1 МКМ іономіцину складала 188 ± 25 НМ, (n = 8) у нейронах контрольних тварин та 85 ± 13 НМ (n = 6) у нейронах тварин із СТЗ-індукованим діабетом. Різниця між амплітудами була статистично достовірною (р < 0.001). Гістограма, яка відображає активацію різних шляхів вивільнення Ca2 з ЕР та їх зміни за умов експериментального діабету, представлена на рисунку 6.

Роль Ca2 -АТФАЗИ ендоплазматичного ретикулуму. При апроксимації спаду Ca2 транзиентів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в присутності 10 МКМ СССР, зясувався яскраво виражений дво-експонентний характер його спаду (Рис. 7). Як у нейронах контрольних тварин, так і в нейронах тварин із СТЗ-індукованим діабетом, у спаді кальцієвого транзиентів були присутні "швидка" та "повільна" експоненти. Сталі часу спаду "швидких" експонент не відрізнялися достовірно та складали 6.3 ± 2.2 с. (n = 15) у нейронах контрольних тварин та 8.4 ± 3.1 с (n = 13) у нейронах щурів із СТЗ-індукованим діабетом. В той же час, сталі часу спаду "повільної" компоненти складали 92 ± 40 с (n = 15) у контрольних та 315 ± 75 с (n = 13) у нейронах щурів із СТЗ-індукованим діабетом відповідно (р < 0.01). При апроксимації спаду Ca2 транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в присутності 10 МКМ СССР та 1 МКМ тапсигаргіну (специфічного блокатора Ca2 -АТФАЗЫ ЕР), зясувалося, що цей спад є моно-експоненціальним. Сталі часу спаду експонент не відрізнялися (з точністю до похибки методу) та складали 75 ± 33 с (n = 6) у нейронах контрольних тварин та 81 ± 41 с (n = 6) у нейронах щурів із СТЗ-індукованим діабетом. Отже, при блокуванні Ca2 -АТФАЗИ ЕР зникає різниця у швидкості виведення кальцію з цитоплазми, між нейронами контрольних та діабетичних тварин, що свідчить про важливу роль Ca2 -АТФАЗИ ЕР у процесах, які лежіть в основі порушення Ca2 гомеостазу за умов експериментального діабету.

Обговорення

Поведінкові тести, на сьогоднішній день, є єдиним джерелом інформації про больову чутливість тварин. В методах дослідження нейропатій широко використовується формаліновий тест, як модель гострого болю з наступною фазою тонічної або інфламаторної болі (Hunskaar S., 1987). Больовий ефект формаліну має двофазний характер, різні фази якого мають різну анальгетичну чутливість. Вважається, що перша фаза відповідає за прямий вплив на ноцицептивні нейрони, тоді як друга, зумовлена запальними процесами та біллю, викликаною запаленням та знімається дією антизапальних фармакологічних речовин (Hunskaar S., 1987). Під час СТЗ-індукованого діабету, ми спостерігали як посилення больової реакції на гострий біль, так і послаблення больової реакції на тонічний "інфламаторний" біль, що свідчить про те, що індукція цукрового діабету диференційовано змінює механізми, які відповідають за різні типи болю. Дослідження змін температурної чутливості за умов діабету, виявили відсутність у діабетичних тварин температурної аллодоніїї та наявність температурної гіпоалгезії. Ці результати узгоджуються з даними Фокса і співавторів (1999) стосовно температурної гіпоалгезії.

Таким чином, стрептозотоцинова модель захворювання цукровим діабетом у щурів супроводжується значними змінами больових реакцій, патофізиологічні причини яких не зясовані остаточно, однак останнім часом усе більше уваги надається порушенням Ca2 гомеостазу, які не лише супроводжують, а й цілком імовірно, є однієї з причин, що призводять до розвитку діабетичних нейропатій. Підвищений рівень [Ca2 ]i у клітинах після деполяризації може призводити до збільшення нейрональної збудливості та збільшення вивільнення нейротрансміттерів (Stanley E., 1997). Експерименти, проведені нами по вивченню зміни внеску різних типів потенціалкерованих Ca2 каналів у генерацію, викликаних деполяризацією [Са2 ]i транзиєнтів, показали достовірне збільшення внеску L- і N- типу кальцієвих каналів за умов експериментального діабету.

Активація L-типу Ca2 каналів в нейронах дорзального рогу може мати специфічне значення для опосередкування повільних, Ca2 потоків, що сумуються та сприяють поступовому й тривалому підвищенню збудливості (Baranauskas G., 1998). Результати, одержані нами та іншими авторами, можуть свідчити як про зміну щільності L- , N- типів Ca2 каналів, так і про зміни фармакологічних та структурних характеристик, формуючих їх субодиниць. Нами виявлені також значні зміни, які відбуваються у внутрішньоклітинних структурах нейронів дорзального рога спинного мозку. Зокрема, спостерігалось значне зменшення вивільнення Ca2 мітохондріями під час діабету, що, імовірно, повязано із зменшенням накопичення Ca2 мітохондріями. При дослідженні роботи внутрішньоклітинних Ca2 депо ендоплазматичного ретикулума, нами були виявлені значні зміни функціонування як ріанодинового так і інозитолтрифосфат-чутливого депо Ca2 .

Причиною зменшення вивільнення Ca2 з ріанодинового депо ЕР може бути, як зменшення закачування кальцію в депо Ca2 -АТФАЗОЮ ЕР, так і безпосереднє зменшення експресії ріанодинового рецептора за умов діабету, як це було показано на діабетичних кардіоміоцитах (Teshima Y. 2000). При дослідженні роботи INSP3-чутливого депо ЕР, нами показано достовірне зменшення вивільнення кальцію, як через глутаматергічний, так і пуринергічний шляхи. При проведенні цих досліджень була встановлена наявність у нейронах дорзального рога спинного мозку метаботропних пуринорецепторів, які, імовірно, розташовані на дистальних дендритах (Kruglikov I.A, 2001). Також встановлено перерозподіл внеску різних типів пуринорецепторов у генерацію [Ca2 ]i транзиєнтів під час діабету, скерований на збільшення внеску іонотропних рецепторів.

Усі вищенаведені результати свідчать про те, що вивільнення Ca2 з депо ЕР, при дії як кофеїну, так і АТФ чи глутамата зменшується за умов експериментального діабету. Можливо, що порушується кожен із зазначених механізмів, або зменшується загальна кількість Ca2 в обох депо ЕР. Непрямим підтвердженням останнього припущення, є зменшення вивільнення Ca2 з депо ЕР при аплікації іономіцину, який, у використаних концентраціях, вивільняє Ca2 з усього ретикулуму (Albert P. 1986).

Для подальшого вивчення цього питання, ми використовували метод дослідження кінетичних характеристик спаду, викликаних деполяризацією кальцієвих транзиентів. Шляхом послідовного виключення механізмів, які відповідають за виведення кальцію з цитоплазми, ми виявили достовірні порушення функціонування Ca2 -АТФАЗИ ЕР, що також може призводити до зменшення вмісту Ca2 в ЕР. Висловлені припущення підтверджуються тим, що за умов діабету, спостерігається безпосереднє зниження рівня експресії Ca2 -АТФАЗИ ЕР уже через 3 тижні після початку захворювання (Teshima Y. 2000).

Таким чином, одержані результати свідчать про виражені зміни функціонування внутрішньоклітинних Ca2 -транспортних та Ca2 -модулюючих структур у сенсорних нейронах щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом уже на ранніх етапах захворювання. Схема, на якій проілюстровані характер змін Ca2 сигналізації наведена на рисунку 8.1. В експериментах, проведених з використанням формалінового тесту, показані достовірні зміни больової чутливості у щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом. Динаміка змін больової реакції в діабетичних тварин, на відміну від контрольних, мала чітко виражений двофазний характер. Інтенсивність першої фази тривалістю 10-15 хв., яка фізіологічно відповідна початковому гострому болю, була достовірно вищою в діабетичних тварин. Інтенсивність другої "тонічної" фази, навпаки, була достовірно вищою в контролі з максимумом на 30 - 40 хв.

2. В експериментах, проведених з використанням методу "гарячої поверхні", встановлено, що температурний больовий поріг не відрізнявся для контрольних та діабетичних тварин та складав 42°С, що свідчить про відсутність у діабетичних тварин температурної аллодінії. Швидкість больової реакції при температурі 48°С, була достовірно меншою в діабетичних тварин, що свідчить про наявність у них температурної гіпоалгезії.

3. При порівнянні [Ca2 ]i транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в клітинах дорзального рога спинного мозку, не виявлено достовірної різниці між контрольними та діабетичними тваринами в базальному рівні [Ca2 ]i, в амплітуді транзиєнтів, викликаних деполяризацією, а також у швидкості наростання Ca2 сигналу. Одначе виявлені достовірні відмінності рівня залишкового Ca2 , який складав 2.8±0.5% та 14.1±1.2% від амплітуди транзиєнтів, викликаних деполяризацією для контрольних та діабетичних тварин відповідно.

4. Фармакологічне дослідження внеску потенціалкерованих Ca2 каналів у генерацію Ca2 транзиєнтів, викликаних деполяризацією, показало, що їх внесок відрізняється у контрольних та діабетичних тварин. Інгібування Ca2 каналів L- та N- типу, відповідними специфічними блокаторами, зростає під час діабету, тоді як внесок каналів Т типу не змінюється.

5. Виявлено достовірні зміни Ca2 акумулюючої функції мітохондрій, у діабетичних тварин порівняно з контрольними. Зменшення амплітуди, викликаних деполяризацією [Ca2 ]i транзиєнтів при розєднанні протонного градієнта на мембрані мітохондрій складало 78%.

6. Показано достовірне зменшення вивільнення Ca2 з ріанодин-чутливого депо ЕР, яке у діабетичних тварин складало 85 %. Останнє підтверджується зменшенням [Ca2 ]i транзиентів у відповідь на аплікацію іономіцину, яке складало 54 %.

7. Виявлено достовірне пригнічення функціонування INSP3-чутливого депо ЕР в нейронах дорзального рога щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом. Зменшення амплітуди метаботропного АТФ-індукованого Ca2 транзиєнта складало 34%, а метаботропного глутамат-індукованого - 54%.

8. При блокуванні Ca2 -АТФАЗИ ЕР за допомогою тапсигаргіна зникає різниця у швидкості виведення Ca2 з цитоплазми, між нейронами контрольних та діабетичних щурів, що свідчить про важливу роль Ca2 -АТФАЗИ ЕР у процесах, які викликають порушення кальцієвого гомеостазу за умов експериментального діабету.

9. Виявлені порушення кальцієвої сигналізації у вторинних сенсорних нейронах дорзального рога спинного мозку, можна розглядати як один з механізмів змін передачі больових сигналів при цукровому діабеті, які призводять до розвитку діабетичної нейропатії.

За одержаними результатами було опубліковано такі праці: 1. N.V. Voitenko, E.P. Kostyuk, I.A. Kruglikov, N.V. Svichar, V.A. Shishkin (1999) Changes in calcium signalling of mammalian nociceptive neurons under diabetes. // Phyziol. Journ. (Kiev), 45 (4), 45-54.

2. N.V. Voitenko, I.A. Kruglikov, E.P. Kostyuk and P.G. Kostyuk (2000) Effect of streptozotocine-induced diabetes on activity of calcium channels in rat dorsal horn neurons // Neuroscience 95 (2), 519-524.

3. P.G. Kostyuk, A.S. Efimov, E.P. Kostjuk, N.V. Voitenko, I.A. Kruglikov (2000) Changes in intracellular turnover of calcium ions in nociceptive neurons in experimental diabetes and influence of blockers of potential-dependent calcium channels upon them // Ukrainian acad. of med. Sci. Journ 6 (4), 637-650.

4. Kruglikov I.A., Shutov L.P., Shishkin V.O., Kostyuk E.P., Potapenko E.S., and Voitenko N.V. (2001) Intracellular mechanisms of changes in the functioning of rat sensory neurones with streptozotocin-induced diabetes mellitus. // Phyziol Journ, (Kiev), 47 (5), 18-25.

Размещено на .ru