Зміна кінетики процесу квантового вивільнення медіаторів в хромафінних клітинах щура при різних типах стимуляції - Автореферат

Хоча, в основному, інформація про ці процеси стала відомою лише декілька останніх десятиліть, однак в багатьох випадках ми не можемо поки зясувати, як всі можливі рівні модуляції насправді використовуються клітиною при її нормальному функціонуванні. Так в хромафінних клітинах, що містять в високих концентраціях адреналін, норадреналін та інші біологічно активні речовини, така регуляція, беззаперечно, необхідна для запобігання масивного неконтрольованого вивільнення катехоламінів в систему кровообігу, що може призводити до важких патофізіологічних ушкоджень і навіть смерті всього організму. Численні протиріччя і навіть діаметрально протилежні висновки в результатах наукових робіт по вивченню звязку кальцієвих каналів і ацетилхолінових рецепторів з процесом екзоцитозу в хромафінних клітинах та можливі відмінності в механізмах запуску секреції при різних типах клітинної стимуляції вказують на значну невивченість даних процесів. Надзвичайна складність досліджень даного плану повязана з необхідністю комплексного підходу до вивчення всієї сукупності регуляторних клітинних механізмів, що виникають при процесі вивільнення в хромафінних клітинах. · Визначити часову динаміку процесу екзоцитозу при екстремальних умовах збудження клітини, які виникають при важких патологічних порушеннях в організмі, використовуючи два окремих способи ініціації процесу вивільнення, що існують в хромафінних клітинах.У вступі обґрунтована актуальність дослідження впливу зміни тривалості та типу стимуляції, що моделюють різні фізіологічні та патофізіологічні стани збудливості хромафінних клітин, сформульована мета та задачі дослідження, наведені відомості про наукову новизну, практичну цінність та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації. Наступним етапом було досліджено чутливість електродів з карбоновими волокнами до різних сполук, що можуть секретуватись хромафінними клітинами при прикладанні певних калібрувальних потенціалів. Так, середня частота появи секреторних подій під час «швидкої фази» складала 4.9±0.7с-1 (n=7), що є достовірно вище, ніж в попередньому випадку (р<0.001), але «залишкова фаза» характеризувалась середньою частотою виникнення амперометричних піків 0.32±0.07с-1 (n=7), що достовірно нижче, ніж у випадку стимуляції клітини ацетилхоліном (р<0.05). Для статистичного аналізу характеристик окремих амперометричних піків було досліджено вибірку із 334 піків від 20 клітин у випадку стимуляції 1ММ пілокарпіну та 215 піків від 7 клітин для ініціації процесу вивільнення 150ММ нікотину. Проте, амплітудні та часові характеристики окремих квантових подій вивільнення при таких сукупних стимуляціях відрізняються як від відповідних значень при простій активації специфічних рецепторів, так і від характеристичних значень секреторних піків, отриманих при деполяризації клітини.На підставі цього запропоновано новий метод ідентифікації адреналіну та норадреналіну, що вивільняються хромафінними клітинами з використанням різних тестуючих постійних потенціалів при безпосередньому вимірюванні процесу вивільнення. Використовуючи різні способи ініціації екзоцитозу в хромафінних клітинах: активації специфічних ацетилхолінових рецепторів та деполяризації клітини, зареєстровано дві окремих кінетичних стадії процесу вивільнення, характеристики яких залежать від типу стимуляції. Показано, що при короткотривалому збудженні, що може відбуватись при нормальній іннервації хромафінних клітин, загальна кількість вивільнених катехоламінів практично не залежить від способу ініціації процесу екзоцитозу. Виявлено, що при довготривалій стимуляції, що може виникати під час важких патофізіологічних станах, постійний рівень вивільнення суттєво залежить від способу збудження клітини. Припускається, рецептор-опосередковані процеси здатні взаємодіяти з специфічними протеїнами, які приймають участь на фінальних стадіях процесу злиття секреторної везікули з плазматичною мембраною ймовірно шляхом формування фузійної пори, можуть змінювати їх конформаційну будову, що в свою чергу може призводити до збільшення загального радіусу пори та прискорення кінетики процесу вивільнення медіатора.

Основний зміст роботи

1. За допомогою застосування електрохімічного методу показана можливість розрізняння специфічних типів нейротрансміттерів по амплітуді та розташуванню окислювальних та відновлювальних піків струму на відповідних циклічних вольтамперограмах. Виявлено, що при дії суміші кожний з медіаторів окислюється або відновлюється на поверхні електроду незалежно від іншого. Визначено характеристики електродів з карбоновими волокнами та показана адекватність їх застосування в електрофізіологічних експериментах на рівні окремих клітин. На підставі цього запропоновано новий метод ідентифікації адреналіну та норадреналіну, що вивільняються хромафінними клітинами з використанням різних тестуючих постійних потенціалів при безпосередньому вимірюванні процесу вивільнення.

2. Використовуючи різні способи ініціації екзоцитозу в хромафінних клітинах: активації специфічних ацетилхолінових рецепторів та деполяризації клітини, зареєстровано дві окремих кінетичних стадії процесу вивільнення, характеристики яких залежать від типу стимуляції. Показано, що при короткотривалому збудженні, що може відбуватись при нормальній іннервації хромафінних клітин, загальна кількість вивільнених катехоламінів практично не залежить від способу ініціації процесу екзоцитозу.

3. Виявлено, що при довготривалій стимуляції, що може виникати під час важких патофізіологічних станах, постійний рівень вивільнення суттєво залежить від способу збудження клітини. При таких умовах активація ацетилхолінових рецепторів буде відігравати ключову роль в підтриманні процесу секреції в хромафінних клітинах ймовірно внаслідок активації механізмів, що опосередковуються специфічними вторинними посередниками. Однак при цьому не виявлено суттєвих відмінностей в ефективності ініціації екзоцитозу при стимуляції обох підтипів ацетилхолінових рецепторів: нікотинових та мускаринових.

4. Показано, що часова динаміка окремих квантових подій вивільнення залежить від способу стимуляції хромафінних клітин. У випадку активації ацетилхолінових рецепторів амперометричні піки мали достовірно меншу тривалість, часи наростання та спаду, проте більшу амплітуду, ніж у випадку деполяризації гіперкалієвим розчином. Не виявлено принципових відмінностей кінетики індивідуальних подій вивільнення при стимуляції різних типів ацетилхолінових рецепторів.

5. Сукупна стимуляція клітини агоністами ацетилхолінових рецепторів та деполяризуючого агенту призводить до появи секреторних подій, часова динаміка яких повільніша, ніж при стимуляції клітин лише агоністами, проте більш транзієнтна, ніж при активації потенціалкерованих Са2 -каналів. Постійність площі амперометричних піків при всіх типах стимуляції свідчить про те, що в процесі вивільнення в хромафінних клітинах виділяється однакова кількість нейротрансміттеру під час процесу вивільнення із окремих секреторних везікул.

6. Моделювання динаміки екзоцитозу окремої секреторної везікули вказує, що зміна кінетичних характеристик індивідуального піку може відбуватися внаслідок зміни радіусу фузійної пори, що утворюється при злитті везікули з плазматичною мембраною.

7. Припускається, рецептор-опосередковані процеси здатні взаємодіяти з специфічними протеїнами, які приймають участь на фінальних стадіях процесу злиття секреторної везікули з плазматичною мембраною ймовірно шляхом формування фузійної пори, можуть змінювати їх конформаційну будову, що в свою чергу може призводити до збільшення загального радіусу пори та прискорення кінетики процесу вивільнення медіатора.

Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації

1. Починюк О.М. Заїка О.Л. Лукянець О.О., Техніка порівняльних амперометричних вимірів для ідентифікації вивільнених нейротрансміттерів. Нейрофізіологія 1998, т. 30, №4/5, ст. 284-287.

2. Заика О.Л. Починюк О.Н. Лукьянец Е.А. Электрохимические исследования индуцируемой секреции катехоламинов из одиночных везикул хромаффинных клеток крысы. Український біохімічних журнал 2001, т. 73, №4, ст. 69-72

3. Zaika O.L. Pochynyuk O.M. Lukyanetz E.A. Comparative studies of calcium transients induced by acetylcholine in rat chromaffin cells. Нейрофізіологія 2002, т. 34, №2/3 ст. 270-272.

Тези доповідей.

1. Заика О.Л. Починюк О.Н. Лукьянец Е.А. Электрохимические исследования индуцируемой секреции катехоламинов из одиночных везикул хромаффинной клетки крысы. Укр. Біохім. Журнал 2000 т. 72, №6 ст. 125.

2. Починюк О.Н., Заика О.Л., Лукьянец Е.А. Амперометрическое исследование секреторных ответов хромаффинных клеток крысы, индуцируемых агонистами ацетилхолиновых рецепторов. Архив клинич. и экспер. медицины 2001, т. 10, №2, ст. 206.

3. Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Lukyanetz E.A. Altering of kinetics of neurotransmitter release measured by amperometry during types of stimulation in rat chromaffin cells. Sulejow 2001 p. 23.

Размещено на .ru