Зберігання сперміїв в умовах гіпотермії для використання в програмі екстракорпорального запліднення ооцитів людини - Автореферат

У проведених раніше дослідженнях (Jacobs M., 2001) було показано, що час попередньої інкубації зрілих ооцитів становить 5 - 6 годин до часу інсемінації, у той час як незрілі ооцити проходять стадію дозрівання 20 - 24 години. Мета і задачі дослідження - визначити умови гіпотермічного зберігання активнорухливих сперміїв людини, які забезпечують високу цілість морфологічних і функціональних властивостей гамет для подальшого використання в програмі екстракорпорального запліднення ооцитів. Вивчити морфологічні й кінетичні показники активнорухливої фракції сперміїв до і після впливу гіпотермічних умов зберігання в середовищах різного композиційного складу (Menezo B2, Хенкса, Ham F-10). Визначити життєздатність сперміїв активнорухливої фракції, що зберігалася в гіпотермічних умовах (80С, 24 години, середовище Menezo B2), при культивуванні в інкубаторі (5% СО2, 370С, середовище Menezo B2) протягом 0-24-48-72 годин. Провести порівняльне дослідження запліднюючої здатності активнорухливої фракції сперміїв нативних та після гіпотермічних умов зберігання (80С, 24 години, середовище Menezo B2) відносно ооцитів різного ступеня зрілості на етапах біотехнологічного циклу програми ЕКЗ, а також каріотипу отриманих ембріонів.Підготовку і дослідження сперми проводили відповідно до рекомендацій ВОЗ (World Health Organization, 1999). Виділення фракції сперміїв зі швидким прогресивним прогресивним рухом (активнорухливі) проводили методом “спливання”, який у процесі роботи було модифіковано. Збереження фракції сперміїв з прогресивним рухом (Паепус Е.Н., 1991) визначали контролем спермограми через 1, 24, 48 і 72 години після виділення з еякуляту фракції сперміїв з прогресивним рухом з використанням середовища Menezo В2 і тієї ж фракції, що пройшла умови гіпотермії. Визначення життєздатності сперміїв проводили методом суправітального фарбування, який грунтується на здатності дегідрогенази живих сперміїв відновлювати молекули еозину (World Health Organization, 1999). Для дослідження умов, необхідних для максимального зберігання морфофункціональних властивостей виділеної з еякуляту активнорухливої фракції сперміїв застосовували різні температурні діапазони, терміни зберігання, та середовища різного композиційного вмісту.Спермії, що були виділені із еякулятів з астеноспермією з застосуванням середовища Menezo B2 або середовища на основі Ham F-10, мали вихідні морфологічні і функціональні показники на 22 % вищі, ніж при застосуванні середовища на основі розчину Хенкса; після гіпотермічних умов зберігання протягом 24 годин композиційний вміст середовищ Menezo B2 і Ham F-10 не впливав на показники збереження кінетичної активності сперміїв, в той час як у середовищі на основі розчину Хенкса цей показник був у 7,6 разів нижчим. Активність акрозину у досліджених зразках сперміїв залежала від температурних умов її зберігання (370С;220С; 40С; 80С); тільки при температурі 80С через 24 години активність ферменту не відрізнялась від вихідних показників; визначення активності акрозину є більш чутливим показником функціонального стану сперміїв в умовах дії температурних факторів, ніж їх кінетична активність. 48-52 (співав.: Грищенко В.І., Піняєв В.І., Петрушко М.П., Луцька Л.І., Крамар М.Й., Юрченко Г.Г.; дисертантом було зроблено літературний пошук щодо реінсемінації ооцитів, проведено виділення ооцитів з фолікулярної рідини, оцінку їх якості, розроблено методику реінсемінації ооцитів, що не запліднилися, сперміями, які зберігалися в умовах гіпотермії). 63-64 (співав.: Грищенко В.І., Чуб Н.Н., Крамар М.Й., Черепанова Т.А., Кучков І.М.; дисертантом було проведено виділення активнорухливої фракції з еякуляту, її зберігання в умовах гіпотермії, дослідження активності ферменту акрозину в сперміях до і після зберігання, узагальнення отриманих результатів). 150 (співав.: Грищенко В.І., Піняєв В.І., Петрушко М.П., Луцька Л.І.; дисертантом було зроблено літературний пошук щодо реінсемінації ооцитів, проведено виділення ооцитів з фолікулярної рідини, оцінку їх якості, розроблено методику реінсемінації ооцитів, що не запліднилися, сперміями, які зберігалися в умовах гіпотермії).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У дисертаційній роботі представлено теоретичне, експериментальне узагальнення та нові рішення наукової проблеми, що стосується вивчення властивостей активнорухливої фракції сперміїв в різних умовах гіпотермічного зберігання та її застосування для інсемінації ооцитів після дозрівання і реінсемінації незапліднених ооцитів людини.

Спермії, що були виділені із еякулятів з астеноспермією з застосуванням середовища Menezo B2 або середовища на основі Ham F-10, мали вихідні морфологічні і функціональні показники на 22 % вищі, ніж при застосуванні середовища на основі розчину Хенкса; після гіпотермічних умов зберігання протягом 24 годин композиційний вміст середовищ Menezo B2 і Ham F-10 не впливав на показники збереження кінетичної активності сперміїв, в той час як у середовищі на основі розчину Хенкса цей показник був у 7,6 разів нижчим.

Концентрація гамет зі швидким прогресивним рухом після гіпотермічних умов зберігання (80С) залежала від такого показника у вихідних еякулятах з астеноспермією. У групах з нормо- (I) та помірною астеноспермією (II) після 24 годин зберігання концентрація сперміїв залишалася нарівні з контролем, після чого кількість гамет зі швидким прогресивним рухом зменшувалася, відповідно, на 41 % і 50 %. Через 72 години активнорухливих гамет у зразках I групи було на 7 % більше, ніж в зразках II групи. Концентрація гамет зі швидким прогресивним рухом у групі зі значною астеноспермією (III) через 48 годин складала тільки 16,5 % від вихідних.

Активність акрозину у досліджених зразках сперміїв залежала від температурних умов її зберігання (370С;220С; 40С; 80С); тільки при температурі 80С через 24 години активність ферменту не відрізнялась від вихідних показників; визначення активності акрозину є більш чутливим показником функціонального стану сперміїв в умовах дії температурних факторів, ніж їх кінетична активність.

Розроблена і апробована методологія застосування сперміїв, що зберігались в гіпотермічних умовах, для запліднення незрілих ооцитів; поетапна інсемінація ооцитів, що знаходились на дозріванні, дає можливість збільшити кількість ембріонів для переносу пацієнтці і підвищити частоту настання вагітності в програмі екстракорпорального запліднення.

Ефективність програми ЕКЗ можна покращити за рахунок збільшення кількості запліднених яйцеклітин, застосовуючи реінсемінацію ооцитів, що не запліднились, сперміями, які зберігались при 80С. При цьому частота хромосомних порушень в ембріонах, отриманих після реінсемінації ооцитів такими сперміями, не перевищує аналогічного показника при використанні нативних гамет.

Розроблена методологія зберігання активнорухливої фракції сперміїв в умовах гіпотермічних температур може бути використана для короткочасного зберігання чоловічих гамет у програмах допоміжних репродуктивних технологій. активнорухливий гіпотермічний екстракорпоральний гамета

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗДОБУВАЧА ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Использование спермиев, хранившихся в условиях гипотермии для реинсеминации неоплодотворенных ооцитов в программе ЭКО // Проблемы криобиологии. - 1998. - № 3. - С. 48-52 (співав.: Грищенко В.І., Піняєв В.І., Петрушко М.П., Луцька Л.І., Крамар М.Й., Юрченко Г.Г.; дисертантом було зроблено літературний пошук щодо реінсемінації ооцитів, проведено виділення ооцитів з фолікулярної рідини, оцінку їх якості, розроблено методику реінсемінації ооцитів, що не запліднилися, сперміями, які зберігалися в умовах гіпотермії).

2. Морфофункциональные характеристики спермиев человека, хранившихся при низких положительных температурах // Проблемы криобиологии. - 1998. - № 4. - С. 63-64 (співав.: Грищенко В.І., Чуб Н.Н., Крамар М.Й., Черепанова Т.А., Кучков І.М.; дисертантом було проведено виділення активнорухливої фракції з еякуляту, її зберігання в умовах гіпотермії, дослідження активності ферменту акрозину в сперміях до і після зберігання, узагальнення отриманих результатів).

3. Беременность и роды после переноса деконсервированных эмбрионов // Проблемы криобиологии. - 2003. - № 3. - С. 99-102 (співавтор.: Петрушко М.П., Геродес Г.Г.; дисертантом було проведене виділення ооцитів з фолікулярної рідини, попередня інкубація ооцитів до інсемінації, виділення активнорухливої фракції сперміїв, інсемінацію, аналіз отриманих ембріонів).

4. Повышение результативности программы ЭКО путем поэтапной инсеминации ооцитов разной степени зрелости спермиями, хранившимися в условиях гипотермии // Медицина сегодня и завтра. - 2004. - №1.- С. 173-176 (співавтор.: Геродес Г.Г., Луцька Л.І.; дисертантом було проведено літературний пошук щодо дозрівання ооцитів різного ступеню зрілості, виділення ооцитів з фолікулярної рідини, оцінку їх якості, проведено серію експериментів щодо інсемінації незрілих ооцитів сперміями, які зберігалися в умовах гіпотермії).

5. Application of sperm stored under hypotermia conditions for reinsemination of non-fertilized oocytes under extracorporal fertilization program // Journal of Assisted Reproduction and Genetics. - 1999. - Vol. 16, № 3. - P. 150 (співав.: Грищенко В.І., Піняєв В.І., Петрушко М.П., Луцька Л.І.; дисертантом було зроблено літературний пошук щодо реінсемінації ооцитів, проведено виділення ооцитів з фолікулярної рідини, оцінку їх якості, розроблено методику реінсемінації ооцитів, що не запліднилися, сперміями, які зберігалися в умовах гіпотермії).

6. Possibilities of using spermatozoa stored under hypothermia conditions for in vitro fertilization // Comptes rendus de LACADEMIE Bulgare des Sciences. - 1994. - Vol. 47, № 10. - P. 109-110 (співав.: Чуб Н.Н., Тодоров П.Т., Піняєв В.І.; дисертантом було проведено: зберігання сперміїв в умовах гіпотермії та запліднення ооцитів).

7. Изучение пенетрационной и оплодотворяющей способности спермиев человека, хранившихся в условиях гипотермии // Бесплодие: Вспомогательные репродуктивные технологии. - К.: Ин-т репродуктивной медицины УАННП. - 1995. - 166 с. (співавтор.: Чуб Н.Н., Піняєв В.І., Луцька Л.І.; дисертантом було проведене зберігання сперміїв в умовах гіпотермії, оцінка кінетичної активності сперматозоїдів до і після зберігання, інсемінацію ооцитів сперміями, що зберігалися в умовах гіпотермії, узагальнення і аналіз отриманих результатів).

8. Morfological and functional integrity of human embryo and sperm after storage // Proc. 31st Annual Meeting Society for cryobiology. - Kyoto (Japan). - 1994. - P. 103 (співавтор.: Грищенко В.І., Чуб Н.Н., Піняєв В.І., Юрченко Г.Г., Крамар М.Й., Чадаєв В.Е., Луцька Л.І.; дисертантом було проведене зберігання сперміїв в умовах гіпотермії, оцінка кінетичної активності сперматозоїдів до і після зберігання, узагальнення отриманих результатів).

9. Morphofunctional, cytogenetic characteristics of gametes, zygotes and embryos after exposure to hypothermia // Proc. The Society for cryobiology “Cryo 95”. - Madison (Wisconsin).- 1995. - № 2-52 (співавтор.: Грищенко В.І., Чуб Н.Н., Піняєв В.І., Юрченко Г.Г., Крамар М.Й., Петрушко М.П.; дисертантом було проведене зберігання сперміїв в умовах гіпотермії, оцінка кінетичної активності сперматозоїдів до і після зберігання, узагальнення отриманих результатів).

10. Способность сперматозоидов, хранившихся при гипотермии, к оплодотворению in vitro // Труды 1 съезда украинского общества криобиологии и криомедицины. - Харьков: Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины. - 1995. - С. 275-276 (співавтор.: Чуб Н.Н., Геродес Г.Г., Піняєв В.І.; дисертантом було проведене зберігання сперміїв в умовах гіпотермії, оцінка кінетичної активності сперматозоїдів до і після зберігання, інсемінація ооцитів сперміями, що зберігалися в умовах гіпотермії, узагальнення і аналіз отриманих результатів).