Моніторингові дослідження епізоотичної ситуації щодо інфекційного ринотрахеїту ВРХ в Україні. Технологія виготовлення вакцини живої проти ІРТ ВРХ та інактивованого імунізуючого препарату. Засоби діагностики та специфічної профілактики захворювання.
При низкой оригинальности работы "Засоби діагностики та профілактики інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби в Україні", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
В Україні з початку 90-х років XX сторіччя відмічено ускладнення епізоотичної ситуації з інфекційного ринотрахеїту ВРХ, цьому сприяла відсутність вітчизняних засобів діагностики та специфічної профілактики. Метою наших досліджень було вивчення поширення ІРТ ВРХ в Україні, обґрунтування необхідності створення системи контролю, профілактики та боротьби з ІРТ ВРХ, розробка принципово нових засобів діагностики та специфічної профілактики інфекційного ринотрахеїту ВРХ. Розроблено технологію виготовлення імунізуючого препарату з штаму 413 бактерій виду Bacillus alvei (деклараційний патент України № 49450 А) та вивчені імунобіологічні властивості цього препарату; запропоновано його використання в препараті для профілактики сальмонельозу та інфекційного ринотрахеїту телят (деклараційний патент України № 60089 А ); вперше в Україні експериментально обґрунтовано й розроблено технологію виготовлення живого вакцинного препарату зі штаму “ІРТ-LG” та вивчено його імунобіологічні та протективні властивості; вивчено культуральні властивості герпесвірусу 1 штаму “ІРТ-LG” й визначено його властивості, як вакцинного штаму (деклараційний патент України № 30385 А). Вивчення поширення ІРТ ВРХ в Україні, ретроспективну діагностику, відпрацювання технології виробництва “Ритравак Б” здобувач проводив за участю провідного наукового співробітника, кандидата ветеринарних наук Кассіча В.Ю.; гістологічні дослідження виконані за участю доктора ветеринарних наук, професора, академіка УААН Краснікова Г.А.; вірусологічні дослідження патматеріалу в реакції імунофлуоресценції здійснювали за участю доктора ветеринарних наук Чечоткіної Н.П., наукового співробітника Кучерявенко Р.А.; біохімічні дослідження крові тварин при застосуванні вакцин живої “ІРТ-LG” та “Ритравак Б” здійснено за участю провідних наукових співробітників, кандидатів біологічних наук Михайлової С.А., Коваленко Л.О.(к.в.н.), Романько М.Є.; імунологічні дослідження виконані за участю провідного наукового співробітника кандидата медичних наук Квачова В.Г. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на звітних сесіях вченої ради ІЕКВМ УААН (Харків, 1993-2001 рр.) та науково-практичних конференціях: “Збереженість молодняка сільськогосподарських тварин - запорука розвитку тваринництва України” (Харків, 1994 р.); “Общая эпизоотология: иммунологические, экономические и методологические проблемы” (Харків, 1995 р.); IV зїзді паразитоценологів України (Харків, 1995 р.); “Ветеринарные и зооинженерные проблемы животноводства” (Витебск, 1996 р.); “Теория и техника передачи, приема и обработки информации” (Туапсе, 1996 р.); “Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми” (Харків, 1997р.); “Лабораторна ветеринарна медицина: фізико-хімічні методи досліджень” (Рівне, 1998 р.); “Біоресурси та віруси” (Київ, 1998 р.); “Науково-технічний бюлетень інституту землеробства і біології тварин” (Львів, 1999 р.); “До сторіччя від дня народження академіка УАСГН Гжицького С.З.” (Львів, 1999 р.); “Інфекційна патологія молодняка сільськогосподарських тварин і птиці” (Суми, 1999 р.); “Стан та перспективи розвитку ветеринарної науки” (Харків, 1999 р.); конференції, присвяченої 70-річчю від дня народження члена-кореспондента УААН і РАСГН Собко А.І.Встановлено, що при негативному імунному фоні до вірусу ІРТ у морських свинок, синтезом специфічних віруснейтралізуючих антитіл до ІРТ в титрі 2,25±0,0 log2, гемаглютинуючих на рівні 3,25±0,5 log2 відреагували тварини, яким вводили культуру Bacillus alvei зі штаму 413. Встановлено, що антиген, виготовлений з використанням бактерій шт.413 Bacillus alvei, в реакції аглютинації (РА) виявив специфічні антитіла до вірусу ІРТ в титрі 5,8±0,37 log2 у пробах сироватки крові телят 3-4 місяців, в титрі 6,7±0,88 log2 у телят 6-місячного віку та в корів 9,0±0,58 log2. Через 14 діб серологічними дослідженнями в РНГА та РН була встановлена наявність специфічних віруснейтралізуючих антитіл до вірусу ІРТ у морських свинок першої групи, яким вводили препарат з бактерій шт.413 Bac.alvei та у тварин третьої групи, яким вводили герпесвірус 1 штам “ІРТ-LG” у титрі 3,0 log2. У телят другої дослідної групи титр специфічних антитіл до вірусу ІРТ склав 8,8±0,58 log2.Через 24 доби рівень антитіл у тварин першої групи дорівнював 8,6±0,31 log2, у тварин другої групи 8,6±0,24 log2, у тварин контрольної групи 5,2±0,37 log2 (Р?0,01). Препарат “Ритравак Б” вводили телятам у дозі 10 см3 з концентрацією 10 млрд. мікробних кл/см3: дворазово з інтервалом 21 добу: першій групі - внутрішньомязово; другій групі - підшкірно; третій групі - інтраназально; чотвертій групі - інтратрахеально; пятій групі (контрольній) вводили МПБ внутрішньомязово.1.Теоретично та експериментально обгрунтувано, розроблено та впроваджено у виробництво ефективні засоби діагностики та специфічної профілактики інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби, удосконалено систему профілактики та боротьби з ІРТ ВРХ в Україні. Штам “ІРТ-LG” герпесвірусу 1 є непатогенний та ареактогенний, для лаб
Вывод
Особливості епізоотичного процесу та клінічного прояву інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби в племінних та товарних господарствах.
У 1996-1997 роках було проведено епізоотологічне обстеження 7 господарств Хмельницької області з метою визначення рівня захворюваності великої рогатої худоби на ІРТ в генітальній формі та встановлення економічних збитків (зниження молочної продуктивності, зменшення виходу телят на 100 корів та збільшення їх падежу. В результаті проведення вірусологічних, бактеріологічних і серологічних досліджень нами встановлено широке розповсюдження збудника ІРТ ВРХ в товарних господарствах Хмельницької області. У пробах сироваток крові ВРХ (від 1 до 12 місячного віку) в ряді колгоспів Полонського району була встановлена серопозитивність у 100% проб із рівнем специфічних до герпесвірусу 1 антитіл 4-12 log2. Вірусологічними дослідженнями патматеріалу в РІФ був ідентифікований антиген герпесвіруса 1. Бактеріологічними дослідженнями встановлено асоціацію умовно-патогенної мікрофлори (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium). Аналогічна епізоотична ситуація з ІРТ ВРХ була встановлена в товарних господарствах інших районів Хмельницької області.
З метою встановлення шляхів розповсюдження ІРТ ВРХ в області був проведений контроль племінних тварин та проб спермопродукції в Хмельницькому облплемобєднанні. За допомогою РІФ був виявлений антиген герпесвірусу 1 в 13% випадків. Серологічними дослідженнями була встановлена наявність специфічних до герпесвірусу 1 антитіл у діагностичних титрах у 41 % проб сироватки крові. Присутність та різниця рівнів специфічних антитіл до герпесвірусу 1 в 3-7 log2 свідчила про можливість репродукції та екскреції вірусу в стаді, що було загрозою для всього поголівя племобєднання та переходу захворювання в латентно-персистуючу форму перебігу. Але головне те, що інфіковані проби сперми являли собою загрозу для тваринництва області та могли сприяти розповсюдженню збудника цієї інфекції в багатьох господарствах.
Епізоотологічне обстеження ВРХ ВАТ племзавода "Тростянець" Ічнянського району Чернігівської області з метою встановлення причини ураження генітальних органів дорослих тварин та респіраторних органів у молодняка виявило, що у 100 % проб сироваток крові тварин були присутні специфічні антитіла до герпесвірусу 1 в титрі 5,4-7,0 log2. Про тривалість циркуляції герпесвірусу 1 в гурті свідчив високий рівень специфічних антитіл у маточного поголівя в титрі 6,0-9,0 log2. Дослідженням проб сперми племінних биків у РІФ було встановлено наявність антигену герпесвірусу 1 ВРХ в 25 % проб. У племінних биків при клінічному обстеженні було визначено ураження слизових оболонок припуція та корню пеніса. Загальний стан тварин племінної станції був задовільний, відсутності апетиту або нервової поведінки зафіксовано не було.
Ці та інші дослідження свідчили про важливість контролю племінних биків та спермопродукції племобєднань на наявність антигену герпесвірусу 1 як одного з шляхів розповсюдження збудника ІРТ ВРХ, реінфекції та підтримування стаціонарності осередка інфекції.
Відсутність контролю при імпорті племінних тварин, сперми та ембріонів на присутність антигену вірусу ІРТ негативно відзначалося на товарних господарствах, де утримували високопродуктивних корів. Обстеження окремих господарств Дніпропетровської області, утримують імпортовану худобу з європейських країн з метою встановлення етіології спалаху захворювання ВРХ з респіраторно-генітальною патологією показало, що в період клінічного прояву хвороби титри специфічних антитіл до герпесвірусу 1 складали 5-9 log2 у 100 % досліджуваних проб, бактеріологічними дослідженнями була виділена Salmonella dublin (35 %), Salmonella typhimurium (20 %). При клінічному огляді гурту встановлено: некрозо-пустульозне ураження слизових оболонок піхви і шийки матки із серозо-гнійними витіканнями у 70 % високопродуктивних корів (голштинської і червоної степової породи). У телят відмічався серозно-катаральний конюнктивіт, геморагічне запалення слизових оболонок носових ходів і трахеї; катаральна бронхопневмонія. Вірусологічними дослідженнями була встановлена наявність антигену герпесвірусу 1 у патологічному матеріалі.
За аналізом результатів проведеної роботи був зроблений висновок, що спалах і загострення захворювання ІРТ у даному господарстві відбулося внаслідок надходження в нього імпортної худоби, яка була приховано інфікована вірусом ІРТ. У супровідних документах не вказувалося на відсутність вірусоносійства, груповий серопозитивний захист або серонегативність тварин до герпесвірусу 1, але в послідуючому фірмою - постачальником наголошувалося про необхідність проведення систематичних щеплень корів вакциною живою або інактивованою проти ІРТ ВРХ.
У результаті проведених нами досліджень встановлено широке розповсюдження ІРТ в господарствах України з високим рівнем їх інфікованості (до 100 %), що завдавало значних економічних збитків господарствам.
Зважаючи на те, що ефективну боротьбу з ІРТ неможливо проводити без вчасної діагностики, нами була визначена задача, спрямована на розробку та впровадження у виробництво вітчизняного набору антигену та сироваток для діагностики ІРТ ВРХ, який би відповідав сучасним вимогам.
Розробка набору антигену і сироваток для діагностики ІРТ ВРХ у реакції аглютинації.
Нами був використаний штам 413 Bacillus alvei, ізольований з личинок бджіл, уражених європейським гнильцем, Смирновою Н.І. (1978 р., м. Вітебськ). За даними автора цей штам перехресно реагував у серологічних реакціях з антитілами специфічними до вірусу ІРТ.
Вивчення морфологічних властивостей бактерій виду Bacillus alvei штамів 413, 502, 37. При порівняльному вивченні ультратонких зрізів клітин Bacillus alvei шт. 413 електронно-мікроскопічним методом, встановлено структурні зміни, що істотно відрізняли їх від бактерій штамів 502, 37 і від загального типу будови мікроорганізмів роду Bacillus. На підставі проведених досліджень встановлено, що бактерії штаму 413 Bacillus alvei відрізняються певним типом змін структури цитоплазми і нуклеоїду мікробної клітини і нагромадженням у них великої кількості нетипових для цього виду мікроорганізмів осміофільних включень-гранул у цитоплазмі.
Вивчення чутливості до антибіотиків бактерій штамів 413, 332, 502 Bacillus alvei. Чутливість бактерій штаму 413 Bacillus alvei визначали в МПБ методом засівів серійних розведень антибіотиків від 10 мкг/см3 до 500 мкг/см3. Відрізняючими властивостями бактерій штамів 413 і 332 Bacillus alvei стала їхня чутливість до ампіциліну і поліміксину: на штам 413 вони діяли стимулюючи (на МПА 8-12мм), у штама 332 викликали зону затримки росту (на МПА - 9-10 мм). На краю зони затримки росту Bacillus alvei, викликаного антибіотиками левоміцетином і доксациліном, відзначений ріст окремих колоній S-форм, що при наступних пасажах на МПБ і МПА забезпечили ріст бактеріальної маси, менш підданої самоаглютинації.
Відзначено стимулюючий вплив на ріст бактерій штаму 413 Bacillus alvei ампіциліну, поліміксину і клоксациліну. Вивчення цього факту методом серійних розведень дало можливість визначити, що оптимальна концентрація цих препаратів для збільшення накопичення бактеріальної маси в МПБ складає: ампіциліну 10 мкг/см3, поліміксину 500 мкг/см3, клоксациліну 10 мкг/см3.
Дослідження антигенних властивостей Bacillus alvei штамів 413,502, 332. З метою порівняльного вивчення антигенних властивостей Bacillus alvei штамів 413, 502, 332, з них були виготовлені серії препарату та проведена гіперімунізація лабораторних тварин. Контрольних тварин імунізували референтним штамом герпесвірусу 1 “ІРТ-LG”. Встановлено, що при негативному імунному фоні до вірусу ІРТ у морських свинок, синтезом специфічних віруснейтралізуючих антитіл до ІРТ в титрі 2,25±0,0 log2, гемаглютинуючих на рівні 3,25±0,5 log2 відреагували тварини, яким вводили культуру Bacillus alvei зі штаму 413. Введення морським свинкам штаму “ІРТ-LG” викликало синтез специфічних антитіл до вірусу ІРТ аглютинуючих у титрі 4,6±0,2 log2, віруснейтралізуючих у титрі 3,0±0,0 log2.
Імунологічна короткочасна відповідь у морських свинок на введення бактеріальних антигенів зі штамів 502 і 332 на низькому рівні (1,14±0,2 log2 та 1,0±0,0 log2 співвідносно) та відсутність їх у подальшому, свідчила про відсутність у цих штамів антигенної спорідненості до герпесвірусу 1. Рання реакція гуморального ланцюга імунної відповіді в інфікованих лабораторних тварин на введення бактерій виду Bacillus alvei (штами 332, 502) обумовлюється присутністю в цих мікроорганізмах бактеріальних ліпополісахаридів, здатних при введенні в організм тварини активізувати клітинний та гуморальний імунітет.
Дослідження специфічності та активності антигену з бактерій штаму 413 Bacillus alvei. Встановлено, що антиген, виготовлений з використанням бактерій шт.413 Bacillus alvei, в реакції аглютинації (РА) виявив специфічні антитіла до вірусу ІРТ в титрі 5,8±0,37 log2 у пробах сироватки крові телят 3-4 місяців, в титрі 6,7±0,88 log2 у телят 6-місячного віку та в корів 9,0±0,58 log2. З контрольною (гіперімунної) сироваткою антиген аглютинував в титрі 8,0 log2. Дані досліджень цих проб у РНГА (6,0±0,32 log2 ) співпадають із показниками в РА (Р?0,001). Дані, отримані при постановці РН (2,6±0,24 log2), корелюють із даними в РА (Р?0,05). Встановлено, що антиген, виготовлений з використанням бактерій штаму 413 Bacillus alvei в РА є специфічним, активним і виявляє специфічні до вірусу ІРТ антитіла у польових сироватках крові тварин на рівні з РНГА та у прямій кореляційній залежності з результатами в РН.
Розробка технології виготовлення набору антигену та сироваток для діагностики ІРТ ВРХ та його апробація. Проводилася комісійна оцінка специфічності та активності створеного набору антигену та сироваток для діагностики ІРТ ВРХ (ІЕКВМ) у реакції аглютинації з гіперімунними специфічними сироватками з набору для діагностики ІРТ ВРХ, серія № 4, від 04.06.93 р. та набору для діагностики ВД ВРХ, серія №4, від 01.03.91р. виробництва Державної Приволзької біофабрики.
Встановлено, що антиген із діагностичного набору (ІЕКВМ), виготовлений з використанням бактерій штаму Bacillus alvei-413, специфічний, активний і виявляє в РА специфічні до вірусу ІРТ антитіла у гіперімунних специфічних комерційних сироватках та в польових сироватках крові тварин у титрі 7,0 log2.
Використання “Набору антигену та сироваток для діагностики ІРТ ВРХ” (ІЕКВМ) у наукових та виробничих лабораторіях ветеринарної медицини України. За даними Харківської обласної державної лабораторії ветеринарної медицини у 1998 році було досліджено 488 проб сироваток крові ВРХ, з яких 326 проб (66,8 %) були позитивними до вірусу ІРТ. Із 25 досліджуваних проб патматеріалів від ВРХ в 23 пробах був визначен антиген герпесвірусу 1.
За даними серологічних досліджень, проведених лабораторією вивчення хвороб молодняка ІЕКВМ в цей період, в господарствах Харківської області рівень серопозитивності до вірусу ІРТ у тварин різного віку складав 90-100 %.
Виконані в 1998 році комплексні ретроспективні дослідження з використанням “Набору антигену і сироваток для діагностики ІРТ ВРХ” допомогли оперативно конкретизувати епізоотичну ситуацію з ІРТ ВРХ в Харківській, Одеській, Хмельницькій, Дніпропетровській областях і визначити стратегію профілактики та боротьби з цим захворюванням.
Аналіз планових досліджень патматеріалу, сперми бугаїв-плідників, сироваток крові бугаїв із племобєднань, резервних бугаїв, корів-донорів, телят із клінічними ознаками перебігу ІРТ за 1999 р. і 1 півріччя 2000 р., проведених Центральною державною лабораторією ветеринарної медицини (ЦДЛВМ), показав на широке розповсюдження ІРТ ВРХ в Україні. Так, у багатьох господарствах титри антитіл до герпесвірусу 1 у племінних бугаїв-плідників коливалися у межах титрів 3-12 log2. Найвищі титри (11-12 log2) антитіл виявлені у тварин в Одеській і Хмельницькій областях. Рівень інфікованості тварин складав до 70 %.
При дослідженні сироваток крові резервних бугаїв у товарних господарствах отримані аналогічні результати , найвищі титри антитіл (12 log2) виявлені у тварин у Харківській області. У Вінницькій, Волинській, Івано-Франківській, Львівській та Миколаївській областях антитіл до герпесвірусу 1 у бугаїв-плідників не виявлено. У биків-донорів титри антитіл до герпесвірусу 1 на рівні 11-12 log2 встановлені в Одеській та Хмельницькій областях.
За інформацією ЦДЛВМ про дослідження на ІРТ ВРХ за 2001 рік зросла кількість позитивних проб при контролі патматеріалу. Найбільша їх кількість реєструвалася у Одеській області - 194 проби; в Черкаській області- 32 проби; в Херсонській області- 17 проб, в Полтавській області- 6 проб, в Хмельницькій області- 3 проби.
Серологічними методами у 2001 році в ЦДЛВМ було досліджено 19975 проб сироваток крові, з них 15842 проби з використанням розробленого нами діагностичного набору, що складає 74,3 % всього обсягу досліджених проб.
Позитивні проби сироваток крові в РА були встановлені у Харківській області - 2081 проба, Черкаській області - 366 проб, Одеській області - 338 проб, Херсонській області - 278 проб, Закарпатській області - 92 проби, Дніпропетровській області - 61 проба, Хмельницькій області - 36, Луганській області- 31 проба.
Приведені дані за 1999-2001 роки вказують на широке та єфективне використання “Набору антигену і сироваток для діагностики інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби “ (ІЄКВМ) ТУУ 46.15.228 -97 у наукових та виробничих лабораторіях ветеринарної медицини України.
Розробка імунізуючого препарату “Ритравак Б” проти інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби.
Розробка технології виготовлення імунізуючого препарату проти інфекційного ринотрахеїту ВРХ. У результаті порівняльних дослідів щодо культивування бактерій штаму 413 Bacillus alvei визначено живильне середовище наступного складу: мясопептонний бульон (МПБ) з додаванням 1 % глюкози та 5 % сироватки крові коней. Максимальна концентрація бактеріальної маси Bacillus alvei 3 млрд. мікробних клітин/см3 досягалася протягом 48 годин культивування. З метою максимальної збереженості імуногенних властивостей штаму 413 Bacillus alvei був визначений ефективний метод його інактивації.
Визначення реактогенності “Ритравак Б” проводили на телятах 1-2-місячного віку. Телятам вводили “Ритравак Б” внутрішньомязово в ділянці середньої третини шиї у дозі 100 млрд. мікробних клітин. Після введення препарату за тваринами спостерігали 10 діб із щоденною термометрією. “Ритравк Б” не викликав патогенної дії але було встановлено підвищення температури тіла тварин на 0,5ОС протягом однієї-двох діб i незначне витікання з носа серозного ексудату.
Визначення імуногенної активності “Ритравак Б” проводили на кролях, яким вводили його підшкірно в ділянці середньої третини шиї в дозі 0,5 млрд. мікробних клітин. Щеплених тварин через 4 доби ревакцинували у дозі 1 млрд. мікробних клітин аналогічним методом. Імуногенну активність препарату характеризував синтез специфічних до герпесвірусу 1 аглютинуючих антитіл у кролів у титрі 5,3±1,31 log2 та віруснейтралізуючих у титрі 3,0 log2.
Визначення імуногенності “Ритравак Б” проводили також на телятах 6-місячного віку, яким вводили його в дозі 2,0 млрд. мікробних клітин внутрішньомязово в верхню третину шиї дворазово з інтервалом 14 діб. На основі отриманих даних зроблено висновок, що інактивований фенолом (1,0 %) імунізуючий препарат з штаму Bacillus alvei 413 забезпечує в організмі щеплених тварин синтез специфічних до герпесвірусу 1 аглютинуючих антитіл у титрі 8,7±0,33 log2 та віруснейтралізуючих антитіл у титрі 5,3±0,33 log2.
Вивчення імуногенності та протективної дії “Ритравак Б” проти інфекційного ринотрахеїту ВРХ на лабораторних тваринах. У досліді використовували морські свинки 4-місячного віку, живою вагою 300-350 г, які були сформовані в 5 дослідних груп по 5 голів. Тваринам першої групи вводили суспензію культури Bac. alvei шт. 413 у дозі 2,0 см3, концентрацією 3 млрд. мікробних кл/см3, внутрішньочеревним методом. Тваринам другої групи вводили шт. 332 Bac. alvei аналогічно у такій саме дозі. Тваринам третьої групи вводили референтний штам герпесвірусу 1 “ІРТ-LG” у дозі 2,0 х 10-6,0ТЦД50см3, внутрішньочеревним методом. Тваринам четвертої групи, які слугували контролем, вводили живильне середовище 199 в аналогічній дозі. Тваринам пятої групи морських свинок вводили епізоотичний штам герпесвірусу 1 “4016” у дозі 2,0 х 10-6,0ТЦД50см3, внутрішньочеревно. Кров для серологічних та імунологічних досліджень відбирали з серця до введення препаратів та через 2 години.
Проведеними дослідженнями встановлено, що в організмі морських свинок при введенні суспензії культури Bacillus alvei штаму 413 синтезуються аглютинуючі антитіла специфічні до вірусу ІРТ у титрі 5,0 log2 та віруснейтралізуючі специфічні антитіла у титрі 3 log2 . На клітинному рівні була встановлена активізація системи мононуклеарних фагоцитів (табл. 1).
Порівняльне вивчення імунної відповіді на введення препаратів із шт. 413 та шт. 332 Bac. alvei показало, що організм дослідних морських свинок в обох групах відреагував підвищенням показника макрофагальної трансформації мононуклеарів (ПМТМ). Однак більш виражене збільшення ПМТМ було відмічено у тварин першої групи (з 41±4,2 % до 71,0±3,3 %), та менш виражене у тварин другої групи (з 39,4±0,9 % до 57,3±3,1 %). Цей факт пояснює появу незначного збільшення рівню гуморального імунітету на введення препарату, виготовленого з бактерій штаму 332 Bacillus alvei.
Препарат, виготовлений з використанням шт.413 Bacillus alvei, індуцирував синтез антитіл у більшій кількості, ніж референтний штам герпесвірусу 1 “ІРТ-LG” (ПМТМ підвищився з 40,6±3,4 % до 55,3±4,9 %). Цей феномен може бути обумовлений звісним імунодепресивним впливом герпесвірусів на імунний статус тварин.
У той же час, відмічено значне підвищення у тварин першої та третьої груп фагоцитарного індексу (ФІ) до 66,4±2,1 % та 72,7±3,5 % (співвідносно), а також фагоцитарного числа (ФЧ) до 16,2±0,2 та 14,5±0,7 (співвідносно) з вірогідністю в порівнянні з контролем - ФІ 37,5±2,5 % та ФЧ 4,1±0,5.
Через 14 діб серологічними дослідженнями в РНГА та РН була встановлена наявність специфічних віруснейтралізуючих антитіл до вірусу ІРТ у морських свинок першої групи, яким вводили препарат з бактерій шт.413 Bac.alvei та у тварин третьої групи, яким вводили герпесвірус 1 штам “ІРТ-LG” у титрі 3,0 log2. У тварин другої групи та контрольних присутність віруснейтралізуючих антитіл у сироватках крові тварин не встановлено.
Таблиця 1
Результати вивчення імуногенної дії препарату з шт.413 Bac. alvei на морських свинках
Групи Штами До імунізації Через 2 години після введення препаратів Через 2 години після введення штама “4016”
ПМТМ% ФІ % ФЧ Титр АТ до ІРТ (log2) ПМТМ% ФІ % ФЧ Титр АТ до ІРТ (log2) ПМТМ % ФІ % ФЧ Титр АТ до ІРТ (log2)
4 група Контроль 38,2±3,0 34,8±1,0 3,64±0,4 1,2±0,2 47,3±3,8* 37,5±2,5* 4,1± 0,5* 1,4±0,2 37,3±5,7* 35,6±2,5 * 3,83±0,6 * 1,0±0,0 (РНГА)
5 група Контроль шт.”4016” 41,0±2,5 37,8±1,4 4,2± 0,3 негат. 68,0±1,8 64,4±2,2 5,2±0,3 негат. 59,6±1,7** 35,6±2,8** 3,7±0,3 ** 2,6±0,4
Примітка: Різниця вірогідна відносно значеня до введення препаратів * - (Р) ? 0,05; ** - (Р) ? 0,5;
ПМТМ - показник макрофагальної трансформації мононуклеарів;ФІ - фагоцитарний індекс;
ФЧ - фагоцитарне число; ** - дослідження через 24 години.
Введення морським свинкам дослідних та контрольної групи епізоотичного штаму герпесвірусу 1 “4016” через 2 години у тварин першої групи викликало зниження ПМТМ до 55,5±3,3 %, а у тварин третьої групи підвищення ПМТМ до 59,5±2,4 %.
Отримані дані характеризують активну нейтралізацію герпесвірусу 1 специфічними антитілами у тварин першої групи та високі імуногенні властивості штаму “ІРТ-LG”. При цьому треба відзначити, що підвищився ФІ з 66,4±2,1 % до 71,3±1,3 %, ФЧ з 16,2±0,2 до 16,9±0,1 у тварин першої групи, а у тварин третьої групи ФЧ з 14,5±0,7 до 15,7±0,4.
Змін клінічного стану морських свинок першої та третьої груп не було встановлено. В той же час у тварин другої групи було встановлено зниження ПМТМ до 40,0±3,2 %, ФІ до 39,0±1,2 %. Через 24-48 годин у морських свинок відмічено пригнічення, зниження апетиту.
У тварин пятої групи через 2 години після введення штаму “4016” було встановлено значне підвищення ПМТМ з 41,0±2,5 % до 68,0±1,8 %; ФІ з 37,8±1,4 % до 64,4±2,2 %; ФЧ з 4,2±0,3 до 5,2±0,3. Однак вже через 24 години ПМТМ знизився на 12,4 %, ФІ на 44,4 %, ФЧ на 26 %, що характеризує депресивний стан системи мононуклеарних фагоцитів.
Збереженість високого рівня ПМТМ у тварин третьої групи (59,5±2,4 %), ФЧ (15,7±0,4) і титру специфічних до вірусу ІРТ антитіл (4,6 log2) при незначному зниженні ФІ, свідчить про активізацію гуморальної ланки імунного захисту та ефекторної стадії імунної відповіді активізованими макрофагами.
Таким чином встановлено, що препарат виготовлений з бактерій Bacillus alvei штаму 413, проявляє імуномодулюючий вплив на стан щеплених тварин й активізує систему мононуклеарних фагоцитів на рівні з референтним штамом герпесвірусу 1 “ІРТ-LG”, має імуногенні та протективні властивості.
Визначення на телятах специфічності антитіл, що синтезуються організмом тварини при введенні імунізуючого препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ . Для визначення специфічності антитіл у сироватках крові дослідних тварин, що синтезуються на введення “Ритравак Б” у дозі 100 млрд мікробних клітин при підшкірному введенні дворазово з інтервалом в 21 добу, вони були досліджені в РН зі штамом "ІРТ-LG" на перещеплюваній культурі клітин трахеї теляти (ТТ) та в РНГА з еритроцитарним антигеном. Дані серологічних досліджень свідчили, що введення препарату активізувало в організмі щеплених тварин синтез специфічних до герпесвірусу 1 аглютинуючих антитіл у титрі 11,5±0,29 log2 та віруснейтралізуючих у титрі 5,0±0,41 log2.
У подальшому був проведений дослід з визначення специфічності антитіл, що синтезуються в організмі телят на введення “Ритравак Б” з використанням в якості контрольного штаму “ІРТ-LG” герпесвірусу 1. Групи тварин для досліду були сформовані з мінімальним рівнем специфічних антитіл до вірусу ІРТ, який дорівнював 5,2 log2.
Тваринам двох дослідних груп (16 голів) внутрішньомязово вводили “Ритравак Б” в дозі 10 см3 (концентрацією 10 млрд. мікр. кл/см3 ). Тваринам контрольної групи (5 голів) вводили аналогічним методом МПБ.
Через 7 діб рівень специфічних антитіл до вірусу ІРТ у щеплених тварин першої дослідної групи дорівнював 8,6±0,2 log2, а через 21 добу він складав 9,4±0,41 log2 та віруснейтралізуючих антитіл у титрі 5,0±0,4 log2 з вірогідністю Р?0,01. Того ж дня телятам першої дослідної групи (11 голів) внутрішньомязово вводили вірусутримуючий матеріал (штам "ІРТ-LG") у дозі 2 х 10-5,5 ТЦД50. Телятам другої дослідної групи (5 голів) вводили аналогічним способом препарат “Ритравак Б”.
Через 5 діб після введення штаму "ІРТ-LG", серологічними дослідженнями в РНГА було встановлено, що титр аглютинуючих антитіл короткочасно знизився з 9,4±0,41 log2 до 3,0±1,14 log2, а через 12 діб підвищився до 8,1±0,44 log2 з вірогідністю Р?0,01. Цей факт свідчив про специфічну нейтралізацію культурального вірусу синтезованими антитілами, які вироблялися на введення препарату “Ритравак Б”. У телят другої дослідної групи титр специфічних антитіл до вірусу ІРТ склав 8,8±0,58 log2.Через 24 доби рівень антитіл у тварин першої групи дорівнював 8,6±0,31 log2, у тварин другої групи 8,6±0,24 log2, у тварин контрольної групи 5,2±0,37 log2 (Р?0,01).
Таким чином встановлено, що імунізуючий препарат “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ стимулює в організмі щеплених тварин синтез антитіл специфічних до вірусу ІРТ й може використовуватися як засіб специфічної профілактики цього захворювання.
Визначення методу введення імунізуючого препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ З метою визначення найбільш ефективного методу введення препарату “Ритравак Б”, в умовах господарства було сформовано чотири дослідні групи телят 6-місячного віку (по 5 голів) та контрольна група тварин (5 голів) з імунним фоном антитіл до вірусу ІРТ у титрі 5,0 log2.
Препарат “Ритравак Б” вводили телятам у дозі 10 см3 з концентрацією 10 млрд. мікробних кл/см3: дворазово з інтервалом 21 добу: першій групі - внутрішньомязово; другій групі - підшкірно; третій групі - інтраназально; чотвертій групі - інтратрахеально; пятій групі (контрольній) вводили МПБ внутрішньомязово. Кров для дослідів відбирали з яремної вени телят до початку досліду та через кожні 7 діб після останнього введення препарату.
При внутрішьомязовому методі введення “Ритравак Б” синтез специфічних до вірусу ІРТ антитіл після першого введення через 21 добу був у титрі 6,6±0,4 log2, а після другого введення у той же термін 8,6±0,2 log2. Через 2 місяці рівень специфічних антитіл утримувався на високому рівні й складав 7,8±0,2 log2.
Підшкірний метод введення характеризувався більш поступовим збільшенням титрів антитіл від 5,4±0,6 log2 через 21 добу після першого введення до 8,0±0,4 log2 через 1 місяць після завершення циклу вакцинації. Інтраназальний метод введення забезпечив максимальний рівень специфічних антитіл - 7,0±0,8 log2 через 14 діб після другого введення препарату й поступово протягом 2 тижнів знижувався до 5,6±0,4 log2. Інтратрахеальний метод введення імуногенного препарату забезпечив синтез специфічніх антитіл до вірусу ІРТ з максимальними показниками через 7 діб (6,4±0,6 log2) та через 2 місяці (6,8±0,8 log2).
При серологічних дослідженнях телят контрольної групи була відмічена динаміка зміни рівня специфічних антитіл, характерна для хронічного перебігу ІРТ ВРХ. Вона відрізнялась періодичністю утворення піків титрів антитіл до герпесвірусу 1 через 7, 14 діб, 2 місяці у титрі 7,4 log2-7,8 log2 і основною характерною ознакою епізоотичного процесу при ІРТ ВРХ - великою різницею рівнів титрів специфічних до вірусу ІРТ антитіл (від негативних до 10,0 log2) в гурті тварин. Найбільш ефективним методом введення препарату проти ІРТ ВРХ “Ритравак Б” був внутрішньомязовий, який забезпечив стабільний ріст специфічних до вірусу ІРТ антитіл на високому рівні (7,8-8,6 log2) протягом 2 місяців (термін досліджень).
Вивчення дії імунізуючого препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ при інтраназальному та пероральному методах введення новонародженим телятам. З метою вивчення імуногенної дії препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ у досліді на новонароджених телятах при комбінованому методі введення (інстиляційним та аліментарним) на клітинному рівні, нами визначалися ПМТМ, ФІ, ФЧ. В якості контролю використовували тварин пасивно імунізованих сироваткою реконвалесцентів, виготовленою в лабораторії вивчення вірусних хвороб молодняка ІЕКВМ.
Досліди проводили на новонароджених телятах живою вагою 50-53 кг (голштинофризької породи). Телятам першої групи (6 голів) препарат вводили через 20-30 хвилин після народження перорально в дозі 200,0 см3 (з концентрацією 2,5 млрд. мікр.кл/см3) та інтраназально по 1 см3 (5 млрд. мікр.кл/см3) в кожну ніздрю за 30-40 хвилин до першої дачі молозива. Тваринам контрольної групи (3 голови) аналогічним методом вводили сироватку крові реконвалесцентів.
Від усіх новонароджених телят до введення, через 24, 48 годин, та 25 діб після введення препарату “Ритравак Б” відбирали кров для проведення гематологічних, імунологічних та серологічних досліджень.
Серологічними дослідженнями встановлено, що після введення “Ритравак Б” через 48 годин відмічається зростання титрів специфічних до вірусу ІРТ антитіл з 4,2±0,54 log2 до 5,7±0,21 log2, а при введенні сироватки крові реконвалесцентів з 2,7±0,33 log2 до 5,7±0,33 log2, що свідчить про мобільну ефективність обох препаратів. При інтраназально-пероральній імунізації препаратом “Ритравак Б”, було відмічено її стимулюючу дію на трансформаційну активність мононуклеарних клітин й зріст їх функціональних характеристик. Через 24 години у тварин дослідної групи ПМТМ крові збільшився з 20,8±1,3 % до 28,0±1,06 %, ФІ підвищався з 28,7±1,0 % до 36,3±1,54°%, а ФЧ збільшилося з 3,3±0,2 до 4,9±0,29 (Р?0,01).
Через 25 діб після введення препарату “Ритравак Б” ПМТМ збільшився до 42,3±1,98 %, а ФІ підвищився до 36,2±1,05 % (Р?0,01), ФЧ залишилося на високому рівні й склало 3,9±0,11 (Р?0,05).
У телят контрольної групи, яких пасивно імунізували сироваткою крові реконвалесцентів, через 24 години відмічено значне підвищення ПМТМ з 20,0±1,7 % до 27,7±1,86 % й незначні збільшення ФІ з 28,0±2,0 % до 29,0±1,15 % й ФЧ з 3,2±0,15 до 3,5±0,34. Але через 25 діб у телят контрольної групи ПМТМ та ФІ знизилися майже до початкових значень (20,0±1,7 % та 28,0±2,0 %), а ФЧ залишилося на високому рівні (3,6±0,4).
Отримані результаті свідчать, що препарат “Ритравак Б” при інтраназальному та пероральному введені активізує синтез антитіл специфічних до вірусу ІРТ (5,7±0,21 log2) та підвищує ПМТМ на 103,3 %, ФІ на 26,4 %, а також посилює фагоцитоз на 18,1 %. Встановлено, що активна імунізація інстиляційним та аліментарним методом у порівнянні з пасивною імунізацією, специфічно активізує ланку імунної реактивності при щепленні телят на високому рівні та впродовж більшого терміну (25 діб, термін досліду).
Комісійна апробація імунізуючого препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ У відповідності з наказом №4 Головного Державного департаменту ветеринарної медицини від 5 лютого 1998 р. комісією, за затвердженою методикою, було проведено випробування імунізуючого препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ.
Апробацію імунізуючого препарату проводили на телятах 8-місячного віку, живою вагою 180-210 кг, з яких були сформовані 2 дослідні групи (по 5 голів) та 1 контрольна (4 голови). Серологічними дослідженнями сироваток крові телят до початку досліду було встановлено в них імунний фон до герпесвірусу 1 у титрах 7,8 log2-8,6 log2. Першій групі телят препарат “Ритравак Б” вводили в дозі 10 см3, телятам другої групи в дозі 20 см3, з концентрацією 10 млрд. мікробних кл/см3, внутрішньомязово в ділянку верхньої третини шиї. Телятам контрольної групи вводили живильне середовище МПБ з інактиватором у дозі 10 см3 аналогічним методом.
Рівень та динаміка синтезу специфічних до вірусу ІРТ антитіл у дослідних тварин двох груп свідчила про високу імуногенну активність препарату впродовж 3 місяців. Після першого введення препарату через 7 діб відмічено незначне зниження рівню титрів специфічних антитіл у тварин першої групи з 8,6±0,24 log2 до 7,2±0,37 log2, а у тварин другої групи з 7,8±0,37 log2 до 5,8±0,37 log2, що може відбуватися в результаті звязування їх з антигеном та асиміляцією організмом. На 21 добу рівні титрів специфічних антитіл до вірусу ІРТ у биків двох дослідних груп підвищилися й дорівнювали 8,0±0,32 log2 та 7,0±0,32 log2. Треба відзначити, що зменшилася різниця рівней титрів специфічних антитіл у групах щеплених телят.
У телят першої групи через 7 діб після щеплення не було встановлено зміни рівня титрів антитіл, але вже на 14 добу він підвищився й дорівнював 10,3±0,75 log2, а на 21 добу відповідно 11,5±0,5 log2 (Р?0,01). Цей показник був піком фази гуморальної реакції “плато” й в подальшому відмічалося незначне зниження рівня антитіл, але він залишався на високому рівні (9,33±1,2 log2-10,33±0,33 log2) протягом терміну досліджень.
Друге щеплення не викликало зниження рівней специфічних антитіл у тварин другої дослідної групи, а їх значне підвищення в лог-фазі вторинної гуморальної відповіді з 7,0±0,32 log2 до 9,33±0,88 log2 свідчило про відсутність супресивної дії препарату. Подальшими дослідженнями було встановлено, що вже через 14 діб після щеплення настала фаза гуморальної відповіді “плато”, тобто стабілізації титрів специфічних антитіл до вірусу ІРТ, який підтримувався протягом послідуючих 2,5 місяців (термін досліду) на високому рівні 10,5±0,5 log2 -11,5±0,5 log2 (Р?0,05).
Встановлені характерні відміни в динаміці гуморальної відповіді телят, що були в стані персистентної інфекції (ІРТ), при щепленні імунізуючим препаратом проти герпесвірусної інфекції.
Вірусологічні дослідження, проведені з метою встановлення факту можливості активації персистуючого герпесвірусу 1 в організмі тварин при введенні препарату “Ритравак Б”, в РН та РІФ показали, що його введення не викликало реактивації вірусу ІРТ в організмі телят, а сприяло зниженню кількості продукуємого вірусу. Подальші вірусологічні дослідження вакцинованих телят підтвердили, що препарат “Ритравак Б” сприяє переходу персистентної герпесвірусної інфекції з динамічного стану в статичне.
Гематологічними дослідженнями встановлено, що введення препарату “Ритравак Б” телятам викликає значне підвищення лейкоцитарного індексу інтоксикації (ЛІІ), тобто активізує проліферацію сегментоядерних нейтрофільних гранулоцитів - рухливих високодиференційних клітин крові, котрі мобільно реагують на функціональні зміни в організмі й виконують фагоцитарну та бактерицидну функції. В подальшому (через 21 добу) зниження ЛІІ свідчило про активізацію ефекторного механізму гуморального імунітету.
Біохімічними дослідженнями в сироватках крові, відібраних від дослідних та контрольних телят до початку щеплення, був визначений рівень IGM, який склав 2,44-2,52 мг/см3, що перевищувало показник норми - 1,5 мг/см3. Цей факт, поряд з показниками серологічних досліджень, свідчив про активацію імунної системи телят. Рівень IGG був нижче норми (15 мг/см3) й дорівнював 14,0-14,58 мг/см3.
Після першого введення препарату “Ритравак Б” рівень IGM незначно зменшився, в той час як кількість IGG різко зменшилася до 12,28-12,4 мг/см3. IGG більш реактивні й продукуються в організмі зі швидкістю 28 мг/кг живої ваги на добу, тому їх значне підвищення протягом наступних 7-14 діб до рівня 15,12-15,49 мг/см3 у тварин обох дослідних груп співпадає з літературними даними й свідчить про імуногенну активність досліджуваного препарату.
Друге введення препарату викликало різке зниження протягом 14 діб рівня IGM до 1,94-2,06 мг/см3, а IGG до 10,7-11,3 мг/см3, але й підвищення їх рівня було стрімким і через 7 діб вони досягли максимальних значень. Високий рівень IGG та IGM через 1 місяць після завершення циклу імунізації був вірогідний (Р?0,05).
Показники рівня IGG та IGM у контрольних телят відрізнялись відсутністю значних коливань й утримувались протягом всього терміну досліджень приблизно на одному рівні: IGM 2,55±0,6-2,53±0,08 мг/см3, IGG 14,58±0,99- 14,5±0,46 мг/см3 .
Подальші (до 3 місяців, терміну досліджень) коливання вмісту імуноглобулінів по класах було незначним й склало: у тварин першої групи IGM 2,74-2,55 мг/см3, IGG 13,4-13,7 мг/см3; у тварин другої групи IGM 2,4-2,55 мг/см3, IGG 14,8-13,9 мг/см3, що характеризувало достатню імунологічну напруженість, викликану щепленням тварин.
Відмічені зміни концентрації вітаміну Е у крові телят дослідних груп. Після першого щеплення концентрація вітаміну Е значно знизилась через 7 діб у першій групі з 34,0±6,0 мг/см3 до 19,2±5,25 мг/см3, а у телят другої групи з 14,8±0,8 мг/см3 до 11,2±2,0 мг/см3. Ця динаміка обумовлюється інтенсивним використанням вітаміну Е як внутріклітинного антиоксиданту, який захищає від окислення ліпідів й збереженості окислювально-відновлюваних реакцій організму. В подальшому, після другого введення препарату, було відмічено зростання вмісту загального токоферолу в тварин першої групи до 25,9±1,4 мг/см3, а в тварин другої групи до 20,5±0,47 мг/см3., що може характеризувати стабільність внутрішнього гомеостазу організму.
Рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) через 7 діб після першого введення “Ритравак Б” підвищився в телят обох дослідних груп, але швидкість збільшення показників у тварин першої групи була вищою, й через 1 місяць після завершення щеплення, у порівнянні з початковим рівнем 0,19 мг/см3 досяг 0,22 мг/см3. Синтез ЦІК характеризував повноцінність імунологічної відповіді щепленого організму й нейтралізацію чужорідного генетичного агенту.
Встановлене нашими дослідженнями зниження IGG та IGM після кожного введення “Ритравак Б” при збільшенні рівня ЦІК, свідчить що вони були активізовані в присутності еквівалентної кількості антигену та антитіл. Відзначено, що доза 100 млрд. мікробних клітин препарату “Ритравак Б” забезпечила більш стабільне підвищення показників ЦІК через 21 добу після введення (з 0,19 мг/см3 до 0,24 мг/см3) з подальшим зниженням до 0,22 мг/см3 протягом 14 діб. Цей факт свідчить, що препарат “Ритравак Б” імуногенний й неспроможний провокувати імунологічний конфлікт в організмі персистентно інфікованих вірусом ІРТ тварин.
Гістологічними дослідженнями встановлена спроможність препарату “Ритравак Б” активізувати первинні та вторинні лімфоідні органи. Встановлено, що дворазове щеплення препарату сприяє збільшенню утворення центрів розмноження в лімфатичних вузлах. Встановлене в гістологічних препаратах селезінки через 3 місяці після щеплення заповнення поверхні дендритних ретикулярних клітин лімфоцитами та макрофагами є посиланням для активізації детер
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
