Взаимодействие Candida аlbicans с нейтрофилами и эпителиоцитами в экспериментальных системах - Статья

Однако, несмотря на значительное число работ, посвященных адгезии и колонизации кандид на слизистых оболочках, недостаточно изучены механизмы регуляции адгезивной фазы инфекционного процесса и роль отдельных факторов слизистых оболочек. Таким образом, исследование механизмов и факторов, влияющих на взаимоотношение С.albicans с эффекторами первого уровня защиты (мукозальные эпителиоциты, нейтрофилы, система комплемента) позволит расширить представления о причинах развития кандидозной инфекции и возможных путях ее регуляции. Определить условия и факторы, влияющие на взаимодействие С.albicans с эпителиоцитами слизистых оболочек, нейтрофилами и комплементом, и изучить механизмы их действия. Определить значимость активации внутриклеточных сигнальных путей, сопряженных с нуклеарным фактором KB и системой митогенактивированных киназ для нейтрофилов и буккальных эпителиоцитов при взаимодействии с C. albicans. Определен вклад внутриклеточных сигнальных путей, связанных с нуклеарным фактором KB и митогенактивированными киназами (ERK1/2 и р38), в реализацию функционального потенциала нейтрофилов и эпителиоцитов в системах с C.albicans.

По материалам диссертации опубликовано 55 печатных работ, в том числе 19 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки, в материалах съездов, конгрессов, симпозиумов, Всероссийских, международных и региональных конференций и совещаний. Издано 3 учебно-методических пособия для студентов медицинских ВУЗОВ, рекомендованных УМО. Одна работа выполнена на уровне изобретения (получено положительное решение о выдаче патента РФ).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 253 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 39 таблицами и 40 рисунками. Библиографический указатель включает 432 источника литературы, в том числе 106 отечественных и 326 зарубежных авторов.

Содержание диссертации нейтрофильный фагоцитоз слизистый импульсный

Материалы и методы исследования

Использовали живые культуры Candida albicans - штаммы 441, 67/846, 201, 258, 290, 601, 852, Candida kefyr 17 и Candida guillermondii 6530-2055, Staphylococcus aureus (штаммы 86М, 66М, 7Н, 1971) и Staphylococcus epidermidis (51-1, 310-2, 178, ССМ 885), Escherichia coli штамм 18М (из коллекций кафедры микробиологии и иммунологии ГОУ ВПО НИЖГМА Росздрава, НИИ гигиены и профпатологии МЗ РФ (г. Нижний Новгород) и Всесоюзного центра глубоких микозов (г. С.-Петербург)). Свежевыделенные клинические изоляты (19 штаммов) получали из бактериологических лабораторий НИИ детской гастоэнтерологии МЗ РФ (г. Нижний Новгород) и Нижегородской областной клинической больницы.

Эксперименты выполнены на 593 белых беспородных крысах, самках и самцах, массой 230 ± 30 г и на 104 самках линии Wistar массой 200 ± 10 г, полученных из питомника «Моховая» (Московская обл.). Животные содержались в стационарных условиях вивария на стандартном рационе. Все манипуляции с животными проводили с применением эфирного наркоза.

В работе были исследованы нейтрофилы 523 крыс и 81 человека, а также эпителиоциты слизистых оболочек 254 человек. Секрет ротовой полости/слюну и сыворотку крови получали от здоровых доноров-добровольцев 18-25 лет (415 человек). Проведено свыше 3000 анализов с использованием различных методов (табл.1)

Культуру C. albicans получали в дрожжевой фазе на агаре Сабуро (24 часа, 37°С) (ННПЦ ГИП, г. Оболенск). Посевы смывали, дважды отмывали (1000g, 15 мин) десятикратным объемом забуференного (РН 7,2-7,4) физиологического раствора (ЗФР), удаляли клеточные агрегаты центрифугированием (40 g, 2 мин) и ресуспендировали в ЗФР в концентрации 107 - 109 клеток/мл (в зависимости от эксперимента). Концентрацию кандид определяли спектрофотометрически.

Мицелиальную форму кандид получали по методу Заславской М.И и соавт. (2006) (рис. 1а). Гифальные элементы кандид использовали в концентрации, эквивалентной по сухому весу дрожжевой фазе.

Таблица 1. Методы оценки реактивности / функциональной активности клеток, использованные при выполнении диссертационной работы

МетодАвтор / техника исследованияОбъем исследований

Оценка люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов крови или экссудатаTono-Oka T. et al.; 1983; Маянский А. Н., Пикуза О.И.,1993; Заславская М.И., Маянский А.Н, 200656 серий исследований

Определение концентрации интерлейкинов (ИЛ-8, ИЛ-6) методом ИФАМаянский Н.А. и соавт., 2000; Заславская М.И. и соавт. 2006 Набор реагентов для ИФА (НПО «Цитокин», г. С.-Петербург)9 серий исследований

Определение растворимых молекул HLA-I методом ИФАЗаславская М.И. и соавт. 2006 Новиков В.В., 1996 Набор реагентов для ИФА (ННИЭМ, Нижний Новгород)7 серий исследований

Определение рецепторзависимой (C3b/ IC3b-, IGG-) и неспецифической адгезии нейтрофилов на гранулах искусственных сорбентов (рис. 1б)Чеботарь И.В. и соавт., 1991325 экспериментов

Оценка активности кандид в системе альтернативного пути активации комплементаЗаславская М.И. и соавт., 200416 серий исследований

Оценка интраплантарного воспаления у крысЗаславская М.И., Маянский А.Н.; 20063 серии исследований

Оценка спонтанной миграции нейтрофиловDavid J.R. et al.; 196420 экспериментов

Определение индекса естественной колонизации буккальных эпителиоцитовМаянский А.Н. и соавт., 1999273 препарата

Определение искусственной колонизация кандид на эпителиоцитахCox F., 1983; Darwazeh A.M. et al.; 1991; Маянский А.Н. и соавт.,20021548 препаратов

Оценка прочности адгезии кандид на эпителиоцитахМаянский А.Н. и соавт.; 200311 экспериментов



Выделение чистой фракции нейтрофилов крови проводили по методу Подосинникова И.С. и соавт. (1981).

Первичную 18-часовую чистую культуру нейтрофилов крови получали при культивировании в среде ДМЭМ ранее описанным способом (Маянский Н.А., Заславская М.И., Маянский А.Н, 2000).

Опсонизацию кандид и зимозана проводили цельной сывороткой, а также в режиме сорбции C3b/IC3b- и IGG-молекул (Маянский А.Н. и соавт., 1989; Заславская М.И., Маянский А.Н.; 2006)

Топографию нейтрофилов исследовали с помощью сканирующего зондового микроскопа TOPOMETRIX SPMLAB (США) в НИОЦ СЗМ (Н.Новгород). Работа на сканирующем зондовом микроскопе выполнена совместно с научным сотрудником центра - Гущиной Ю.Ю.

Изучение активности кандид и зимозана в системе альтернативного пути активации комплемента (АПАК) проводили с сывороткой, где был возможен только альтернативный путь активации (Kozel T. R, et al., 1987).

Искусственную колонизацию кандид на эпителиоцитах осуществляли способом, описанным ранее (Маянский А.Н. и соавт.,2002). Определяли индекс адгезии, т.е. среднее количество кандид в пересчете на один эпителиоцит (канд/эп) после просмотра 100 эпителиальных клеток. Эксперименты по оценке адгезивных реакций в системе «Candida albicans - эпителиоциты» выполнены совместно с сотрудниками ГОУ ВПО НИЖГМА Росздрава (г.Нижний Новгород): асс. Махровой Т.В., доц. Салиной Е.В., асс. Луковой О.А. (каф. микробиологии и иммунологии) и асс. каф. госпитальной педиатрии Абаджиди М.А. при непосредственном участии автора.

Оценку влияния различных факторов на адгезию в системе «C.albicans- буккальные эпителиоциты» определяли после предварительной обработки клеток соответствующими реактивами с последующей отмывкой ЗФР. Нековаленто связанные компоненты удаляли с поверхности клеток раствором 0,1% додецилсульфата натрия (ДДС) (Kozel T.R. et al., 1987).

Экстракт нейтрофилов, стандартизованный по миелопероксидазе, получали, используя обработку клеток 0,1% тритоном Х-100 (Suzuki K. et al., 1983).

Сыворотку и слюну, истощенные по антителам к кандидам получали способом, описанным ранее (Махрова Т.В. и соавт.; 2005). Полноту истощения субстрата (слюны, сыворотки) по антителам к кандидам оценивали в реакции энзим-меченых антител по методу Астафьева Д.Г. (1987).

Оценку естественной колонизации проводили путем подсчета бактериальных клеток, адгезированных на эпителиоцитах. Для этого из суспензии эпителиоцитов готовили мазки, фиксировали метанолом (10 мин) и окрашивали 0,25% водным раствором азура А (“Sigma”, США). Индекс естественной колонизации оценивали по числу бактериальных клеток в пересчете на один эпителиоцит (бакт/эп). Учитывали средний результат после подсчета 100 эпителиоцитов.

Блокаду нуклеарного фактора KB и внутриклеточных митогенактивированных киназ ERK1/2 и p38 в нейтрофилах и эпителиоцитах проводили путем инкубации клеток с соответствующими ингибиторами (Заславская М.И., 2005; Заславская М.И., Маянский А.Н., 2007).

Моделирование орального кандидоза у крыс осуществляли по методу Samaranayake Y.H. et al. (2001).

Некогерентное импульсное излучение (НКИ) инфракрасного, видимого и ультрафиолетового диапазона получали с помощью генератора высокоэнергетических импульсов (ВНИИЭФ, г. Саров) (Спиров Г.М., и соавт., 2005). Напряженность электромагнитного поля между электродами достигала 100 КВ/м, ток в канале искрового разряда - 1 КА. Источник генерации искровых разрядов работал с заданным распределением импульсов во времени в режиме с частотой 1 Гц (1 имп/сек). Длительность каждого разряда составляла 5-20 мсек, энергия - 5Дж в одном разряде. Объекты помещали в зоне излучения на расстоянии 2,0-2,5 см от электродов генератора НКИ. В экспериментах in vitro (16 серий экспериментов) использовали суспензию кандид (5·104 кл/мл) или эпителиоцитов в ЗФР. Толщина слоя клеточной суспензии при обработке НКИ составляла 2-3 мм. Жизнеспособность клеток после воздействия НКИ определяли по трипановому тесту, а также сравнивая количество КОЕ кандид, выросших при посеве из опытных и контрольных образцов. Для оценки эффекта НКИ in vivo были проведены испытания (5 серий исследований) на лабораторных крысах линии Wistar.

Подсчет лейкоцитарной формулы крови осуществляли по общепринятой методике (Меньшиков В.В.; 1987).

Уровень сиаловых кислот в суспензии клеток определяли с помощью набора реагентов «Сиалотест-100» (НПО Экосервис, С.-Петербург) согласно рекомедациям фирмы-производителя.

Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран клеток C. albicans эритроцитов и плазмы крови человека определяли методом хемилюминесценции (Кузьмина Е.И.,1983).

Статистическую обработку данных проводили по общепринятой методике (Реброва О.Ю., 2003). Рассчитывали среднюю арифметическую и ее стандартную ошибку (М ± m). Достоверность различий оценивали при помощи критериев Стьюдента (t) или Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия расценивали как статистически значимые при р<0,05. Взаимосвязь параметров оценивалась методом корреляционного анализа, определяя коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs). Результаты исследования обрабатывались с использованием прикладных программ EXEL и «STADIA 4..51».

Результаты исследования и их обсуждение

Нейтрофил-стимулирующая активность дрожжевой и мицелиальной форм Candida albicans

Сравнивали способность дрожжевой и мицелиальной форм C.albicans стимулировать продукцию нейтрофилами активных форм кислорода, цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-6) и образование растворимых форм мембранных антигенов HLA-I класса.

Все тест-культуры C.albicans (штаммы №№ 258, 290, 852, 601) в дрожжевой фазе вызывали более сильную люминол-зависимую хемилюминесценцию (ХЛ) нейтрофилов по сравнению с мицелиальными элементами (табл.1).

Таблица 1. Показатели кандида-индуцированной ХЛ нейтрофилов в системах с дрожжевой и мицелиальной формами Candida albicans, M ±m

Штаммы C. albicansХЛ в системах с дрожжевой формой (ХЛ-ДФ) (103 имп/мин)ХЛ в системах с мицелиальной формой (ХЛ-МФ) (103 имп/мин)Отношение ХЛ-МФ/ ХЛ-ДФ (количество раз)

258 179,5 ± 12,8 153,2 ± 8,91,17 ± 0,03

290 247,8 ± 96,8 116,4 ± 42,6 *1,91 ± 0,13

601156,8 ± 18,4 124,9 ± 11,81,76 ± 0,23

852 126,1 ± 10,3 97,6 ± 4,61,69 ± 0,17

* - достоверные отличия относительно дрожжевой формы (p <0,05)

Так как уровень индуцированной ХЛ нейтрофилов коррелирует со способностью фагоцитов вступать в адгезивные реакции (Bellavite P. et. al., 1994), была исследована вовлеченность специфических и неспецифических адгезинов разных морфологических форм в стимуляцию кислород-зависимых реакций нейтрофилов. После термической обработки (70°С, 40 мин) дрожжевые элементы тест-культуры C.albicans штамм 601 значительно слабее, чем мицелиальные, индуцировали ХЛ нейтрофилов (0,6 ± 0,2·103 имп/мин против 9,6 ± 3,2·103 имп/мин; р<0,05). Это указывало на то, что C. albicans в дрожжевой фазе обладают более широким набором термолабильных адгезинов (предположительно, белковой природы), обеспечивающих контакт с нейтрофилами. После обработки кандид трипсином (1мг/мл, 1ч, 37°С; “Spopha”,Чехия) наблюдалось снижение нейтрофил-стимулирующей активности дрожжевой формы в 1,3 ± 0,1 раза (p <0,05); такая же обработка не влияла на стимулирующую активность псевдомицелия.

Формирование нейтрофилами псевдоподий после контакта с кандидами исследовали с помощью атомного силового микроскопа TOPOMETRIX SPMLAB (США) в НИОЦ СЗМ (Н.Новгород). Было показано, что образование псевдоподий нейтрофилами наступало через 5 мин после контакта с C. albicans, и не зависело от морфологической формы кандид.

Ингибирование активности микротрубочек нейтрофилов колхицином (1мкг/мл, 30 мин, 37°С; “Sigma”, США) приводило к достоверному (p<0,05) снижению нейтрофил-стимулирующей активности C. albicans - в 1,71 ± 0,03 для дрожжевой формы и в 1,44 ± 0,04 раз для псевдомицелия. Подавление активности микрофиламентов цитохалазином В (1мкг/мл, 30 мин, 37°С; “Sigma”, США) не меняло реактивности нейтрофилов в системе с кандидами.

Сравнивали способность нейтрофилов активироваться опсонизированными дрожжевыми и гифальными элементами кандид. Дрожжевую или мицелиальную форму C. albicans штамм 601 обрабатывали цельной сывороткой, а также в режиме сорбции C3b/IC3b-компонента комплемента или молекул IGG (Заславская М.И., Маянский А.Н.,2006). После обработки цельной сывороткой или ее субкомпонентами (IC3b/C3b-, IGG-) мицелиальная и дрожжевая формы индуцировали сходную ХЛ нейтрофилов (p>0,05).

Была исследована способность дрожжевых элементов и псевдомицелия C. albicans вызывать продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-8 и ИЛ-6 нейтрофилами in vitro (Заславская М.И., Маянский А.Н., 2006). Отмечен более высокий синтез ИЛ-8 и ИЛ-6 в системах с мицелиальной формой C. albicans штамм 601 (p<0,05) (табл.2).

Инактивация кандид (70ОС, 40 мин) не влияла на лидирующие позиции гифальных элементов по синтезу ИЛ-8, но нивелировала их различие в способности индуцировать ИЛ-6. Можно предположить, что более интенсивная продукция нейтрофилами провоспалительных цитокинов в присутствии псевдомицелия может служить дополнительным механизмом сдерживания инвазии и диссеминации кандид.

Таблица 2. Продукция нейтрофилами ИЛ-8, ИЛ-6 и SHLA- I в системах с дрожжевыми (ДФ) или мицелиальными (МФ) формами Candida albicans штамм 601, M ± m

Eaiaeau a nenoaia ИЛ-8 (пкг/мл)ИЛ-6 (пкг/мл)SHLA-I (усл.ед./мл)

Eiio?ieu (aac eaiaea)208,8 ± 23,2 66,9 ± 12,2 43,2 ± 4,1

живые ДФ505,0 ± 113,4 *165,3 ± 17,8* 111,6 ± 34,5 *

живые МФ934,0 ± 127,8*/ **221,3 ± 28,4*/** 219,7 ± 47,8*/ **

инактивированные ДФ392,9 ± 68,8 *141,3 ± 32,6 * 81,5 ± 9,5 *

инактивированные МФ643,1 ± 102,1*/***148,2 ± 19,4* 191,1 ± 20,3*</***>

* - достоверные отличия относительно контроля (p <0,05)

** - достоверные отличия относительно системы с живыми ДФ (p <0,05)

*** - достоверные отличия относительно инакивированных ДФ (p <0,05)

Инкубация нейтрофилов с различными морфологическими вариантами С.albicans in vitro вызывала увеличение концентрации растворимых форм мембранных антигенов HLA I класса (SHLA-I) (p<0,05). При этом как нативные, так и инактивированные гифы сильнее стимулировали поступление SHLA-I в инкубационную среду, чем дрожжевые элементы (p<0,05) (см. табл.2). Это может указывать на более сильный дестабилизирующий эффект псевдомицелия гриба на Т-зависимые реакции макроорганизма.

Таким образом, мицелиальная форма C. albicans слабее стимулирует кислород-зависимую биоцидность фагоцитов и, одновременно, активнее индуцирует синтез нейтрофилами молекул, дестабилизирующих гомеостаз. Это означает, что мицелиальная форма C. albicans, по сравнению с дрожжевой, обладает большей вирулентостью, реализуемой в системах с нейтрофилами.

Активность C. albicans в системе альтернативного пути активации комплемента

Оценивали вклад альтернативного пути активации комплемента (АПАК) в опсонин-зависимые взаимодействия нейтрофилов с C.albicans. Использовали кандиды в дрожжевой фазе - нативные или опсонизированные в системе АПАК (Заславская М.И., и соавт., 2004). Для сравнения использовали зимозан (“Sigma”, США), представляющий собой полисахарид клеточных стенок Saccharomyces cerevisiae, сходный с углеводными компонентами клеточных стенок кандид (Vazquez-Torres A., Balish E., 1997; Cannon R.D., Chaffin W.L.,1999) и известный как классический активатор АПАК (Pillemer L. et al., 1956). Зимозан использовали в концентрации, эквивалентной сухому весу C. albicans.

Нативные C. albicans сильнее стимулировали ХЛ нейтрофилов, чем зимозан (табл. 3). Для разных штаммов C.albicans показатели варьировали от 8,7 ± 1,4 ·104 имп/мин (штамм 441) до 30,8 ± 4,1· 104 имп/мин (штамм 67/846). Нейтрофил стимулирующая активность C. kefyr и C. guillermondii была соответственно 11,3 ± 4,3 · 104 имп/мин и 6,6 ± 3,0 · 104 имп/мин. В системе с неопсонизированным зимозаном ХЛ нейтрофилов была самой слабой - 5,5 ± 0,7 · 104 имп/мин.

Таблица 3. Опсоническая активность кандид и зимозана в системе АПАК, M ± m

СубстратыКратность усиления ХЛ нейтрофилов в системах с субстратами после опсонизации в системе АПАК (количество раз)

Зимозан18,8 ± 6,9

Eaiaeau (aeau/ooaiiu):Живая (нативная) культураOaeoay (a?aoay) eoeuoo?a

C.albicans 6011,2 ± 0,4*12,0 ± 1,8**

C.albicans 67/8460,9 ± 0,3*-

C.albicans 44 13,1 ± 0,6*20,5 ± 2,4**

C.albicans 2011,3 ± 0,4*-

C. kefyr 172,4 ± 1,0*-

C. guillermondii 6530-20554,9 ± 1,6*22,0 ± 5,0**

* - достоверность различий относительно зимозана (р<0,05)

** - достоверность различий между живыми и убитыми кандидами (р<0,05)

После опсонизации в системе АПАК живые кандиды имели более низкую (р0,05).

Опсонизация гретых (убитых) культур С. albicans, приводила к значительному усилению активности нейтрофилов (см. табл. 3). Это указывало на то, что термолабильные компоненты клеточной стенки кандид ответственны за низкую эффективность АПАК-зависимой опсонизации и могут блокировать сорбцию опсонических молекул на поверхности кандид или вызывать деградацию опсонинов системы комплемента.

Острая воспалительная реакция на фоне дестабилизации внутрисосудистого гомеостаза, индуцированного Candida albicans

Процесс нарушения внутрисосудистого гомеостаза был смоделирован внутривенным введением белым беспородным крысам зимозана (10 мг/мл; “Sigma”, США) или живых C.albicans штамм 601 (5·108 кл/мл) в 0,2 мл ЗФР (Заславская М.И., Маянский А.Н., 2004; 2006). Спустя 0,5-1-4-24 ч у крыс вызывали асептическое воспаление путем введения в брюшную полость 5 мл стерильного изотонического 10% раствора пептона. Через 4 часа после внутрибрюшинной инъекции (время максимального накопления нейтрофилов в экссудате) животных декапитировали, промывали брюшную полость 20 мл ЗФР, отбирали перитонеальное содержимое и оценивали гистологические показатели.

Обнаружен феномен, который был обозначен как «острая мобилизационная блокада» нейтрофилов. Он проявлялся в резком сокращении количества нейтрофилов, эмигрировавших в брюшную полость спустя 30-60 мин после внутривенного введения зимозана или C.albicans по сравнению с контролем (инъекция ЗФР) (р<0,05). Феномен не зависел от природы индуктора местного воспаления: он был также воспроизведен при введении в брюшную полость лиофилизированных клеточных стенок Staphylococcus aureus, штамм ССМ 885 (5мг/мл) в 5 мл ЗФР (р<0,05).

Для проверки системности реакции была изучена миграционная активность нейтрофилов на модели острой воспалительной реакции, в подушечках лап у крыс. В качестве раздражителя использовали агрегированный (63°С, 30мин) иммуноглобулин человека. Наблюдали снижение интенсивности острой интраплантарной воспалительной реакции в 1,5 раза в на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови (р>0,05).

Феномен «мобилизационной блокады» нейтрофилов не было связан с сокращением внутрисосудитстого пула циркулирующих нейтрофилов (р>0,05). Кроме того, нейтрофилы сохраняли способность прикрепляться к объектам, несущим специфические (C3b/IC3b-, IGG-) и неспецифические лиганды, а также способность к спонтанной миграции in vitro (р>0,05).

Изучено функциональное состояние очага острого воспаления на фоне нарушения внутрисосудистого гомеостаза, индуцированного C.albicans. Сокращение притока нейтрофилов в очаг воспаления не сопровождалось изменением общего уровня спонтанной и латекс-индуцированной ХЛ (ИХЛ) перитонеального экссудата. В то же время спонтанная ХЛ (СХЛ) отдельных нейтрофилов в экссудате резко усиливалась: 11,1 ± 4,9 ·103 имп/мин у экспериментальных крыс и 2,9 ± 0,1 ·103 имп/мин в контрольной группе животных (р<0,05). Уровень удельной ИХЛ эксудативных нейтрофилов также повышался и составлял 36,9 ± 13,2 ·103 имп/мин в контроле и 151,9 ± 69,8 ·103 имп/мин в опыте (р<0,05). Повышение ИХЛ отдельных фагоцитов говорило о том, что внутрисосудистая циркуляция кандид оказывает стимулирующий эффект на нейтрофилы, усиливая их реактивность (кислород-зависимую биоцидность).

Адгезивные реакции в системе «Candida albicans - эпителиоциты»

На предварительном этапе была разработана экспериментальная тест-система для изучения адгезии C. albicans на эителиоцитах. Эксперименты показали отсутствие достоверных различий адгезивных реакций с буккальными эпителиоцитами человека между музейными культурами C. albicans и штаммами, выделенными из разных источников (язык, кишечник, влагалище). Для проведения дальнейших исследований был выбран штамм C. albicans 601, который отличался средними, но наиболее постоянными показателями адгезии (рис.2). Была определена оптимальная экспозиция кандид с эпителиоцитами (37°С, 30 мин), при которой результаты эксперимента не зависели от жизнеспособности C. albicans, не давали ко-адгезии кандид и обеспечивали прочность связывания по фиколл-верографиновому тесту 60,8 ± 9,0%.

Значение метаболической активности клеток для реализации адгезии в системе «Candida albicans-буккальные эпителиоциты». Опыты проводили с подавлением метаболизма буккальных клеток (4°С), блокадой гликолиза (фторид натрия; 200ММ, 15 мин, 37°С), ингибированием синтеза белка (циклогексимид, “Sigma”,США; 16 мкг/мл, 30 мин, 37°С), при выключении реакций цитоскелета (микротрубочек или микрофиламентов) колхицином и цитохалазином В (“Sigma”,США; 1 мг/мл, 30 мин, 37°С). Эсперименты выявили снижение адгезивности эпителиоцитов на холоду, при торможении гликолиза, подавлении синтеза белка и реакций цитоскелета, что говорило об активной роли эпителиальных клеток при взаимодействии с кандидами (табл.4).

Таблица 4. Уровень адгезии C.albicans штамм 601кандид на эпителиоцитах при различных вариантах метаболической активности клеток, М ± m

Функции эпителиоцитов, подвергавшиеся ингибированиюКандиды в системеКонтроль: адгезия кандид на интактных эпителиоцитах (канд/эп)Адгезия кандид на фоне блокады функции эпителиоцитов

абсолютное значение (канд/эп)% адгезии относительно контроля

Iauay iaoaaiee?aneay aeoeaiinouживые12,2 ± 1,36,2 ± 0,4*52,2 ± 1,7*

убитые10,9 ± 1,35,7 ± 0,7*52,0 ± 2,9*

Гликолизживые10,1 ± 0,74,7 ± 0,3 *52,2 ± 2,4*

Синтез белкаживые10,2 ± 0,63,7 ± 0,1 *36,6 ± 1,9*

Активность микротрубочекживые9,5 ± 0,65,7 ± 1,0 *60,3 ± 2,2*

убитые9,6 ± 1,18,3 ± 1,2 **85,8 ± 2,8**

Активность микрофиламентовживые9,7 ± 2,05,6 ± 1,5 *57,9 ± 2,9*

убитые9,4 ± 0,88,6 ± 1,7 **90,7 ± 4,5**

* - достоверность различий относительно контроля (интактные эпителиоциты) (р<0,05)

** - достоверность различий относительно эксперимента с живыми кандидами (р<0,05)

Установлено, что адгезия кандид на буккальных клетках складывается из двух механизмов. Один из них не зависит от уровня метаболической и цитоскелетной активности эпителиоцитов. Взаимодействие между эпителиальными клетками и кандидами, в этом случае носящее пассивный характер, не связано с рецепторами кандид, а определяется неспецифическим механизмами, такими как: гидрофобные, вандерваальсовы и электростатические взаимодействия. Второй механизм является результатом взаимодействия метаболически активных клеток и лучше всего проявляется в физиологичных условиях (37°С).

Эксперименты позволили установить, что блокада цитоскелета эпителиоцитов не меняла уровень адгезии убитых кандид на буккальных клетках, но, в то же время, вызывала существенное снижение адгезии живых кандид в системе (см. табл.4). Это позволило думать о том, что сам процесс закрепления живых кандид способен усиливать адгезивность эпителиоцитов через изменение реактивности элементов цитоскелета буккальных клеток.

Значение метаболической активности кандид для реализации адгезии в системе «Candida albicans-буккальные эпителиоциты». Исследовали значение метаболической активности самих кандид для реализации их адгезии на эпителиоцитах. В отличие от клеток человека, адгезивная активность кандид снижалась только при ингибировании синтеза белка. В этом случае предварительная обработка живых кандид циклогексимидом уменьшала показатель адгезии почти наполовину (42,1 ± 5,2% от уровня эксперимента с нативными кандидами). Это указывало на то, что адгезивные реакции C.albicans могут определяться как механизмами, не зависящими от метаболизма клеток, так и связанными с белок-синтезирующей активностью самих кандид.

Влияние факторов слюны на адгезивные реакции в системе «Candida albicans-буккальные эпителиоциты». Цельная слюна вызывала снижение адгезии кандид на буккальных клетках в 2,8 раза (р<0,05) (табл.5). Это показывало, что адгезия кандид включает два компонента, один из которых блокируется слюной, а другой не подвержен ее влиянию.

После обработки кандид в обычном режиме (37°С) слюной, истощенной по антикандидозным антителам, наблюдали ослабление антиадгезивного эффекта (р<0,05). Следовательно, антитела слюны вносят существенный вклад во взаимоотношения кандид с буккальными клетками, обеспечивая 62% от общего антиадгезивного эффекта ротовой жидкости.

При обработке кандид истощенной по антителам слюной при 4°С антиадгезивный эффект слюны был меньше, чем при 37°С (р0,05). Предположительно, речь идет о факторах ферментной природы, которые способны вызывать структурные изменения поверхностных компонентов кандид.

Таблица 5. Влияние цельной и истощенной по антителам к кандидам слюны /сыворотки на адгезию C.albicans штамм 601 к буккальным эпителиоитам, М ± m

Субстрат для обработки кандидРежим инкубации кандид с субстратом% адгезии относительно контроляАнтиадгезивный эффект субстрата(%)

Контроль (нативные кандиды)37°С--

Цельная слюна37°С36,0 ± 3,1*64,0 ± 8,4*

4°С45,4 ± 3,6*55,5 ± 3,9*

Истощенная (по антителам) слюна37°С75,7 ± 11,524,3 ± 9,4

4°С 90,9 ± 0,9 ** 9,1 ± 0,1**

Цельная сыворотка37°С 26,5 ± 1,6 *73,5 ± 1,4*

4°С 45,4 ±2,3*/**54,6 ± 2,7 */**

Истощенная (по антителам) сыворотка37°С 44,2 ± 4,2 *55,8 ± 2,2 *

4°С 87,7 ± 1,6 **12,3 ± 1,4**

* - достоверность отличий относительно контроля (р<0,05)

** - достоверность различий относительно эксперимента при 37°С (р < 0,05)

Влияние эффекторов воспалениия на адгезивные реакции в системе «Candida albicans-буккальные эпителиоциты». Обработка кандид (30 мин, 37°) экстрактом нейтрофилов (концентрация 30·106 кл/мл) вызывала незначительное повышение уровня адгезии C. albicans на эпителиальных клетках - 136,5 ± 8,0% (р=0,05). Тот же экстракт при обработке С3b-сефадекса G50, Fine (Pharmacia, Швеция), вызывал почти полное снижение С3b-зависимой адгезии нейтрофилов на гранулах сефадекса, что указывало на его выраженную протеолитическую активность.

Экссудат, принимающий участие в воспалении, включает антитела, комплемент и другие элементы, способствующие или препятствующие воспалительной реакции. Это определило круг задач, связанных с изучением сывороточных факторов на адгезивные реакции кандид.

Пул сыворотки вызывал снижение адгезии кандид на буккальных эпителиоцитах в 3,6±0,2 раз (р<0,05). После обработки C. albicans сывороткой, истощенной кандидами на холоду (4°С,30 мин; удаление антител без активации комплемента) адгезивный эффект снижался в 2,0 ± 0,1 раз (р<0,05). Это говорит о том, что антитела вносят существенный вклад во взаимоотношения кандид с эпителиальными клетками, отвечая примерно за 24% общего антиадгезивного эффекта сыворотки.

Для изучения природы антиадгезивных факторов, не связанных с антителами, проводили обработку C. albicans при 37ЄС или 4ЄС сывороткой, истощенной по антителам к кандидам. При 4°С антиадгезивный эффект сыворотки был значительно ниже, чем при 37°С (р0,05). Можно предположить, что температурозависимое антиадгезивное действие сыворотки связано с другими факторами (возможно, ферментами), структурно модифицирующими адгезины кандид.

Влияние бактериальных факторов на адгезивные реакции в системе «Candida albicans-буккальные эпителиоциты». Кандидоз может протекать как смешанная инфекция, в связи с этим нами изучено влияние на взаимоотношения кандид с буккальными клетками метаболитов золотистого и эпидермального стафилококка, которые могут подключаться к воспалительному процессу на этапах мукозального и кожного кандидозов.

Метаболиты S. aureus (штаммы 86М, 66М, 7Н, 1971), но не S. epidermidis (штаммы 51-1, 310-2, 178) снижали адгезию кандид на буккальных эпителиоцитах. При инкубации (60 мин, 37°С) кандид с супернатантами суточных культур золотистого стафилококка (выращенных на жидкой среде ДМЕМ; ГУП ИПВЭ, г.Москва) таким действием обладали все четыре штамма стафилококка. Максимальное снижение адгезии (в 2,6 ± 0,1 раз) наблюдалось под действием метаболитов штамма 86М. Эффект был необратимым (обработка 0,1% раствором ДДС не возвращала исходной адгезивной активности C. albicans) и предположительно объяснялся ферментативным действием секреторных продуктов золотистого стафилококка на адгезины кандид. Об этом косвенно свидетельствовало ослабление адгезивной активности кандид при их обработке проназой (комплекс бактериальных протеаз) (“Fluka”, Швейцария; 1мг/мл; 1 ч,37°С).

В отличие от экспериментов с C. albicans, обработка буккальных клеток метаболитами золотистого стафилококка не влияла на жизнеспособность и адгезивность эпителиоцитов.

Адгезивные реакции C. albicans и эпителиоцитов, полученных от доноров разного возраста и из различных источников. Уровень искусственной колонизации C. albicans буккальных эпителиоцитов у взрослых (11,2 ± 2,6) не отличался существенно от показателей у детей 6-8 лет (16,0 ± 5,1). В то же время естественная колонизация нормальной микрофлорой того же эпителия была почти в три раза выше в детском возрасте (14,3 ± 6,9 у взрослых и 40,6 ±19,0 у детей (р>0,05)). Это показывает, что возрастные различия в естественной колонизации буккальных клеток не затрагивают их чувствительности к искусственному заселению факультативной микрофлорой, в частности кандидами.

Эксперименты показали наличие сходной адгезивности мукозальных клеток, взятых из разных биотопов - буккального и вагинального эпителия (р>0,05). Наличие прямой корреляции между показателями искусственной колонизации C. albicans у обоих типов эпителиальных клеток говорит о сходстве их рецепторного аппарата, взаимодействующего с кандидам.

Функциональный и морфологический статус эпителиоцитов способен меняться на фоне патологических состояний (Рыжавский Б.Я., Холодок Г.Н., 1995; Хусаинова И.С. и соавт.,1997; Маянский А.Н. и соавт.,1999; Цепов Л.М. и соавт., 1999). Мы исследовали изменение адгезивных реакций эпителиоцитов слизистых оболочек при поверхностном кандидозе (кандидный онихомикоз, вагинальный кандидоз) и хронической некандидозной патологии (бронхиальная астма). Уровень естественной колонизации буккальных эпителиоцитов в группе детей (6-12 лет) с кандидозным онихомикозом (17 человек, проходящие лечение в ФГУ «Нижегородский кожно-венерологический научно-исследовательский институт Росздрава») был выше, чем у здоровых (25 человек): 83,6 ± 23,5 бакт/эп и 40,7 ± 16,2 бакт/эп соответственно (р>0,05). Показатели искусственной колонизации были сходными у здоровых детей (14,0 ± 5,1 бакт/эп) и у детей с кандидозными поражениями (11,6 ± 4,3 бакт/эп) (р>0,05).

Под наблюдением находилось также 19 детей в возрасте 4-12 лет в периоде обострения бронхиальной астмы (проходившие лечение в стационаре ГУ «Нижегородская областная детская клиническая больница»). Контрольную группу составили 36 практически здоровых детей 5-12 лет. Было обнаружено увеличение адгезивности эпителиоцитов по отношению к C. albicans у детей с бронхиальной астмой. Так, у 30 из 36 здоровых детей показатели адгезии C. albicans на буккальных эпителиоцитах были ниже 10 и в среднем составили 6,8 ± 0,9 канд/эп. Иная картина наблюдалась в группе детей с бронхиальной астмой: лишь в одном из 19 случаев результат оказался ниже 10 при среднем показателе 15,3 ± 2,8 канд/эп (р < 0,05).

Изучение естественной и искусственной колонизации вагинальных эпителиоцитов у здоровых небеременных женщин (15 человек), здоровых беременных женщин (17 человек) и беременных с кандидозом (13 человек), получавших консультации на кафедре акушерства и гинекологии ГУ ВПО «НИЖГМА Росздрава» (на базе МЛПУ ГКБ №40, Н.Новгород), дало следующие результаты.

У здоровых беременных женщин уровень естественной колонизации (16,6±8,1 бакт/эп) был несколько ниже, чем аналогичные показатели у здоровых небеременных женщин (23,2±10,5 бакт/эп) (р>0,05). Наличие кандида-зависимого воспалительного процесса во влагалище у беременных ассоциировалось с еще более низкими показателями естественной колонизации вагинального эпителия (13,8±6,2 бакт/эп) (р>0,05). Показатели кандида-индуцированной искусственной колонизации у здоровых беременных (7,6±1,3 канд/эп) и больных кандидозом (6,3 ± 1,6 канд/эп) не отличались от показателей у здоровых небеременных женщин (8,4 ± 2,5 канд/эп) (р>0,05).

Причиной такого «расщепления» адгезивных реакций эпителиоцитов у пациентов разных групп может быть изменение морфологии или интенсивности экспрессии рецепторов под влиянием медиаторных (например, цитокиновых) воздействий или ферментов мукозальных секретов на фоне перестройки системного гомеостаза и/или на уровне слизистых оболочек (Weinmeister R.D., Dal Nogare A.R.,1994).

Участие внутриклеточных сигнальных путей во взаимодействии нейтрофилов и эпителиоцитов с Candida albicans

Изменение реактивности клеток человека в ответ на внеклеточные стимулы опосредуется через внутриклеточные сигнальные пути, осуществляющие передачу активирующего сигнала с поверхности на их генетический аппарат. Показано, что основную транслирующую функцию в клетках выполняют внутриклеточные регуляторы генной транскрипции, такие как нуклеарный (транскрипционный) фактор-?B (NF-?B) (Barnes P.J., Karin M.,1997; Jobin Ch., Sartor R.B.,2000; Baldwin A.S.,2001) и митоген-активированные протеинкиназы (MAP-киназы) (Tian W. et al.,2000; Zarubin T., Han J.,2005).

Для определения значения нуклеарного фактора KB (NF-KB) проводили исследования в режиме его подавления путем инкубации (90 мин, 370С, 100 MM) нейтрофилов с протеасомным ингибитором - ALLN (“Sigma”,США) (Dahan S. et al.,2002; Carlson D.L. et al., 2003). Контролем служили интактные клетки.

Блокада NF-KB приводила к снижению уровня адгезии C. albicans штамм 601 на буккальных эпителиоцитах в 1,7 ± 0,6 раза (p0,05). A oi ?a a?aiy, eiioaeo iaeo?ioeeia n eaiaeaaie, iiin?aaiaaiiuo ?a?ac C3b/IC3b-молекулы, приводил к снижению ИХЛ в 1,2 ± 0,3 раза (p< 0,05).

Мы предположили, что подобный эффект связан с тем, что C. albicans используют уникальный механизм связывания СЗB/IC3b-молекул, после чего последние утрачивают способность к взаимодействию с CR1 и CR3 рецепторами на нейтрофилах (Gilmore B.J. et al., 1988). В пользу этого свидетельствовали эксперименты с другим объектом, опсонизированным в режиме АПАК: блокада NF-?B снижала способность СЗB/IC3b-опсонизированного зимозана стимулировать нейтрофилы (p< 0,05). На фоне блокады NF-KB отмечено увеличение уровня спонтанной хемилюминесценции нейтрофилов в 4,6 ± 2,1 раза (p< 0,05). Это указывало на сопряженность NF-KB с базовым уровнем окислительного метаболизма клеток.

Для определения роли внутриклеточных MAP- киназ (ERK1/2 и p38) проводили исследования в режиме их блокады в нейтрофилах и эпителиоцитах путем прединкубации клеток (60 мин,370С, 20MM) со специфическими ингибиторами U0126 (“Sigma”, США) (Tian W. et al.,2000) и SB203580 (“Sigma”, США) (Jiang Y. et al., 1996; Terada L. S. et al., 1999). В контроле использовали интактные клетки.

Блокада p38 и ERK1/2 существенно не меняла уровня адгезии C.albicans на буккальных эпителиоцитах и спонтанной ХЛ нейтрофилов (р>0,05), но приводила к снижению кандида-индуцированной ХЛ (ИХЛ) нейтрофилов. Снижение уровня ИХЛ наблюдалось при инкубации нейтрофилов с нативными кандидами (p0,05).

Фунгицидный эффект некогерентного импульсного излучения в системах с Candida albicans

В связи с появлением штаммов C. albicans, обладающих устойчивостью к антибиотикам (Анкирская А.С. и соавт 2006; Выборнова И.В. и соавт., 2008; Baddly J.W., Moser S.A.,2004; Cualco L. et al., 2007) несомненный интерес представляет поиск агентов и факторов, обладающих выраженной фунгицидной активностью и не приводящих к формированию резистентных клонов.

Действие некогерентного импульсного излучения на Candida albicans и буккальные клетки in vitro. При воздействии НКИ (1Гц) миллисекундной длительности диапазона 180-800 нм (режим 300 секунд) на посевы кандид на агар Сабуро (в чашках Петри) нами был обнаружен биоцидный эффект в отношении тест-культур C. albicans (штаммы 601, К101/99, 441) и C. kefyr штамм 17. Биоцидный эффект НКИ был неспецифичен и наблюдался также в отношении бактериальных тест-культур: S. epidermidis штамм 51-1 и E. coli штамм 18М.

Эксперименты с суспензией C. albicans показали, что биоцидный эффект отмечался, начиная с минимальных доз облучения (25 секунд) и был сильно выражен в режимах от 200 секунд и более (р <0,05).

Установлено, что действующим фактором НКИ, обеспечивающим фунгицидный эффект, является УФ-излучение (около 59,6%). Кроме того, 40,4% активности НКИ зависит от иных факторов, не связанных с тепловым воздействием, предположительно, свободных радикалов и активных форм кислорода, образующихся в зоне газового разряда (Базелян Э.М., Ражанский И.М.,1988; Буранов С.Н. и соавт. 1995; Иванова И.П. и соавт., 2004).

Изучено влияние некогерентного импульсного излучения на C. albicans и изолированные клетки организма человека - буккальные эпителиоциты. Эксперименты показали, что НКИ в режиме 300 секунд снижает более чем в 2 раза адгезию кандид на эпителиоцитах (р0,05).

НКИ влияло не только на функционирование, но и на структуру рецепторного аппарата изучаемых клеток. Так, при действии НКИ на культуру C.albicans штамм 601 или на буккальные эпителиоциты оба типа к