Взаємодія лізоциму з модельними ліпідними мембранами - Автореферат

Лізоцим, гідролітичний фермент із широким спектром антимікробних, протипухлинних та імуномодулюючих властивостей, відіграє важливу роль у різноманітних фізіологічних процесах. Теоретичним підґрунтям наявних літературних даних про параметри звязування лізоциму з ліпідним бішаром є моделі адсорбції, які не враховують електростатичні ефекти та статистичні особливості білок-ліпідних систем, а також можливість самоасоціації адсорбованого білка та латерального перерозподілу ліпідів. отримати ізотерми звязування лізоциму з модельними мембранами різного складу, визначити параметри асоціації лізоциму з ліпідним бішаром та зясувати, як ці параметри залежать від вмісту та хімічної природи аніонних фосфоліпідів; зясувати особливості впливу лізоциму на структурно-динамічний стан ліпідного бішару, встановити кореляцію між поверхневим потенціалом мембрани та характером модифікуючої дії білка; методом індуктивно-резонансного переносу енергії (ІРПЕ) дослідити просторову організацію комплексів лізоциму з ліпідами, визначити глибину занурення білка у ліпідний бішар та оцінити здатність білка до ініціювання латерального перерозподілу ліпідів у негативно заряджених модельних мембранах.Розділ 1 присвячений аналізу літературних даних, які відображають сучасні уявлення про молекулярні механізми взаємодії лізоциму з мембранами. Відзначається, що стабілізація лізоцим-ліпідних комплексів забезпечується електростатичними та гідрофобними взаємодіями, відносні внески яких залежать від поверхневої густини заряду ліпідного бішару, іонної сили та РН середовища, молярного співвідношення ліпід:лізоцим, тощо. IMG_d4924695-998e-4b16-8636-8b207a479b78 , числа ліпідних молекул, що утворюють контактну ділянку в білок-ліпідних комплексах) - використовували континуальні моделі нелокалізованої адсорбції, які враховують перекривання потенційних мембранних ділянок звязування білка, ефект виключеної площі, а також можливість самоасоціації звязаного ліганду: а) мономодальна модель - припускає, що конформаційний та агрегаційний стан лізоциму не змінюється при адсорбції, б) мультимодальна модель - враховує можливість переходів між різними конформаційними станами адсорбованого ліганду чи адсорбції ліганду на гетерогенній поверхні, що містить центри звязування, які відрізняються за розміром та вільною енергією адсорбції, в) модель двох станів - базується на припущенні, що адсорбований білок може знаходитись тільки в двох станах - мономера та za-мера, г) кластерна модель - розглядає високогетерогенну популяцію агрегованого білка (кластери білка довільної форми та розміру). Це дозволяє припустити, що в основі спостережуваного зниження інтенсивності флуоресценції флуоресцеїну при утворенні білок-ліпідних комплексів лежить адсорбція мономерів лізоциму на поверхні мембрани та перенос мітки в примембранне оточення зі зниженим значенням РН. Розділ 4 присвячено вивченню структурних змін лізоциму та модельних мембран при утворенні білок-ліпідних комплексів методами флуоресцентних зондів, гасіння власної флуоресценції білка та часороздільної флуоресцентної спектроскопії.У дисертаційній роботі зроблено внесок у вирішення однієї з найважливіших проблем сучасної молекулярної біофізики - встановлення фізико-хімічних закономірностей білок-ліпідних взаємодій. Розвинуті моделі електростатично-контрольованої адсорбції білка на поверхні мембрани, які враховують можливість самоасоціації звязаного ліганду. Вперше виявлено зміни форми ізотерм адсорбції білка з гіперболічної на сигмоїдну при підвищенні поверхневого електростатичного потенціалу ліпідного бішару. Методом гасіння власної флуоресценції білка та часороздільної флуоресцентної спектроскопії виявлено обмеження внутрішньомолекулярної рухливості лізоциму при звязуванні з ліпідним бішаром. З використанням мембранних флуоресцентних зондів пірену та ДФГТ виявлено зменшення вільного обєму ліпідного бішару та ступеня упорядкування ацильних ланцюгів ліпідів внаслідок занурення лізоциму в гідрофобну область мембрани.

2. Основний зміст роботи

У дисертаційній роботі зроблено внесок у вирішення однієї з найважливіших проблем сучасної молекулярної біофізики - встановлення фізико-хімічних закономірностей білок-ліпідних взаємодій. З використанням різних модифікацій методу флуоресцентної спектроскопії проведене комплексне дослідження асоціації лізоциму з модельними ліпідними мембранами. Отримані у роботі дані формують підґрунтя для розуміння молекулярних механізмів, що лежать в основі реалізації біологічних функцій білка.

1. Розвинуті моделі електростатично-контрольованої адсорбції білка на поверхні мембрани, які враховують можливість самоасоціації звязаного ліганду. В рамках цих моделей визначені рівноважні параметри звязування лізоциму з модельними мембранами різного складу.

2. Вперше виявлено зміни форми ізотерм адсорбції білка з гіперболічної на сигмоїдну при підвищенні поверхневого електростатичного потенціалу ліпідного бішару. Доведено, що це є наслідком агрегації мембранозвязаного лізоциму. Показано, що хімічна природа фосфоліпідів впливає на кількісні, але не на якісні характеристики адсорбційної поведінки лізоциму.

3. Методом гасіння власної флуоресценції білка та часороздільної флуоресцентної спектроскопії виявлено обмеження внутрішньомолекулярної рухливості лізоциму при звязуванні з ліпідним бішаром. Встановлено, що найбільш імовірною причиною цього ефекту є утворення міжмолекулярних контактів між мономерами білка. Отримані аргументи на користь безпосередньої участі Trp62 в олігомеризації лізоциму.

4. З використанням мембранних флуоресцентних зондів пірену та ДФГТ виявлено зменшення вільного обєму ліпідного бішару та ступеня упорядкування ацильних ланцюгів ліпідів внаслідок занурення лізоциму в гідрофобну область мембрани. Встановлено, що конденсуюча дія білка на ліпідний бішар посилюється при зростанні поверхневого електростатичного потенціалу мембрани.

5. Вперше проведено дослідження спектральних властивостей нових сквараїнових зондів у ліпідних та білок-ліпідних системах. Показано, що цим флуорофорам притаманна висока чутливість до змін фізико-хімічних властивостей ліпідного бішару. На основі аналізу розподілу сквараїнових зондів між ліпідною та білковою фазами охарактеризовано закономірності впливу лізоциму на структурно-динамічний стан ліпідних мембран. Визначені наступні механізми дії білка на молекулярну організацію ліпідного бішару: дегідратація мембрани, упорядкування ацильних ланцюгів, латеральний перерозподіл ліпідних молекул.

6. За допомогою методу індуктивно-резонансного переносу енергії досліджено просторову організацію комплексів лізоциму з ліпідами. Визначена глибина занурення білка у ліпідний бішар. Вперше методом ІРПЕ отримані докази на користь латерального перерозподілу ліпідних молекул при сорбції білка.

7. На основі узагальнення сукупності отриманих даних запропонована концептуальна модель взаємодії лізоциму з ліпідами, яка передбачає таку послідовність подій: адсорбція білка на поверхні ліпідного бішару > дестабілізація структури білка > модифікація структурно-динамічного стану мембрани > вбудовування лізоциму в ліпідний бішар > агрегація мембранозвязаного білка.

1. Ioffe V.M., Gorbenko G.P. Lysozyme effect on structural state of model membranes as revealed by pyrene excimerization studies // Biophys. Chem. - 2005. - Vol. 114. - P. 199-204.

2. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Cardiolipin effect on the lipid bilayer structure: pyrene excimerization study // Вісник ХНУ імені В.Н. Каразіна № 665, Біофізичний вісник. - 2005. - Т. 15(1). - С. 104-107.

3. Gorbenko G.P., Ioffe V.M., Kinnunen P.K.J. Thioflavin T behavior in lysozyme-lipid systems // Вісник ХНУ імені В.Н. Каразіна № 716, Біофізичний вісник. - 2005. - Т. 16(2). - С. 30-33.

4. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A., Tatarets A.L., Patsenker L.D., Terpetsching E.A., Dyubko T.S. A new fluorescent squaraine probe for the measurement of membrane polarity // J. Fluoresc. - 2006. - Vol. 16 (1). - P. 47-52.

5. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Tatarets A.L., Patsenker L.D., Terpetschnig E.A. Examining protein-lipid interactions in model systems with a new squarylium fluorescent dye // J. Fluoresc. - 2006. - Vol. 16 (4). - P. 547-554.

6. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Kinnunen P.K.J., Tatarets A.L., Kolosova O.S., Patsenker L.D., Terpetschnig E.A. Tracing lysozyme-lipid interactions with long-wavelength squaraine dyes // J. Fluoresc. - 2007. - Vol. 17. - P. 65-72.

7. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Deligeorgiev T., Gadjev N., Vasilev A. Fluorescence study of protein-lipid complexes with a new symmetric squarylium probe // Biophys. Chem. - 2007. - Vol. 128. - P. 75-86.

8. Gorbenko G.P., Ioffe V.M., Kinnunen P.K.J. Binding of lysozyme to phospholipid bilayers: evidence for protein aggregation upon membrane association // Biophys. J. - 2007. - Vol. 93. - P. 140-153.

9. Ioffe V.M., Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Structure of model lipid and protein-lipid membranes as revealed by pyrene excimerization studies // Тези доп. I Української наукової конференції «Проблеми біологічної і медичної фізики». - Харків. - 2004. - С. 126.

10. Ioffe V.M., Domanov Ye.A. Electrostatically driven lipid demixing in lipid-protein membranes as revealed by resonance energy transfer // Тези доп. IV Харківської конф. молодих вчених і науковців «Радіофізика та НВЧ електроніка». - Харків. - 2004. - С. 32.

11. Ioffe V.M., Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Estimation of the creation of liposomal form of the anticeptic preparation of lysozyme // Тези доп. науково-технічної конференції «Від фундаментальних досліджень до прогресу в медицині». - Харків. - 2005. - С. 25.

12. Ioffe V.M., Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Conformational transitions in lysozyme as revealed by fluorescence study // Труды XV Международной конференции по химической термодинамике. - Москва. - 2005. - С. 350.

13. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Pyrene lateral diffusion in the lipid bilayer: effect of model membrane composition // Тези доп. V Харківської конф. молодих вчених і науковців «Радіофізика та НВЧ електроніка». - Харків. - 2005. - С. 104.

14. Ioffe V.M., Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Fluorescence study into lysozyme effect on the structure of model membranes // Proc. of the 15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress. - Montpellier, France. - 2005. - published in European Biophysics Journal, V. 34. - P. 699.

15. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Kinnunen P.K.J. Pyrene maleimide as a probe for monitoring lysozyme aggregation upon membrane association // Тези доп. II Всеукраїнської науково-технічної конференції «Актуальні питання теоретичної та прикладної фізики та біофізики. Фізика. Біофізика - 2006». - Севастополь. - 2006. - С. 60.

16. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A., Kinnunen P.K.J. Lysozyme forms amyloid-like fibers in lipid environment // Тези доп. IV Зїзду Українського Біохімічного товариства. - Харків. - 2006. - С. 18.

17. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Deligeorgiev T., Vasilev A., Gadjev N. Fluorescence anisotropy studies of lysozyme-lipid interactions // Тези доп. IV Зїзду Українського Біофізичного товариства. - Донецьк. - 2006. - С. 297.

18. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Deligeorgiev T., Vasilev A., Gadjev N. A new squarylium probe for biomedical applications // Proc. of the International Symposium on Organic Chemistry. - Sofia, Bulgaria. - 2006. - P. 84.

19. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Kinnunen P.K.J. Formation of lysozyme aggregates in membrane environment // Proc. of the VI European Biophysics Congress. - London, UK. - 2007. - P. 3.

20. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A., Kinnunen P.K.J. Time-resolved fluorescence probing of lysozyme-lipid association // Proc. of the 10th Conference on Methods and Applications in Fluorescence. - Salzburg, Austria. - 2007. - P. 257.

21. Ioffe V.M., Gorbenko G.P. Cholesterol effect on structural state of model lipid membranes // Тези доп. III Всеукраїнської науково-технічної конференції «Актуальні питання теоретичної та прикладної фізики та біофізики. Фізика. Біофізика - 2007» - Севастополь. - 2007. - С. 77.

22. Trusova V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A., Kinnunen P.K.J. Protein-lipid interactions as determinant of lysozyme fibrillization // Proc. of Keystone Symposium «Molecular Basis for Biological Membrane Organization». - Big Sky, Montana, USA. - 2008. - P. 70.