Структура мембранных белков, их выделение и солюбилизация. Определение молекулярной массы субъединиц и нативного белка с помощью гидродинамических методов. Радиационная инактивация, инфракрасная спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния.
Цель работы: ознакомление с методами изучения мембранных белков. Поставленная цель раскрывается через следующие задачи: исследовать структуру мембранных белков; Известно, что более трети структурной части генома кодирует мембранные белки, однако среди известных пространственных структур лишь менее половины процента принадлежит белкам этого класса.Основная роль липидов в составе мембран заключается в стабилизации бислойной структуры, а белки являются активными компонентами биомембран. Белки первого типа, называемые периферическими белками, связаны с мембраной в основном ионными взаимодействиями. Если обработать препарат мембран буферным раствором с высокой концентрацией солей, белки этого типа освобождаются от мембраны и переходят в буфер. Эти протеины или погружены в толщу липидного бислоя, или пронизывают мембрану насквозь (трансмембранные белки). Все интегральные белки можно выделить. только разрушив мембрану.Очистка и характеристика мембранных белков ставят перед исследователем целый ряд специфических проблем, с которыми он обычно не сталкивается, работая с растворимыми белками. Поэтому для их солюбилизации и очистки приходится применять детергенты или другие разрушающие мембрану вещества. Для этого, в частности, можно попытаться провести реконструкцию, т.е. встроить очищенный белок обратно в мембрану. Функциональную активность некоторых мембранных белков, таких, как ионные каналы или транспортные белки, можно охарактеризовать и измерить только в реконструированных мембранных системах. При солюбилизации детергентами возникает вопрос о возможности избирательного извлечения из мембраны именно тех компонентов, которые интересуют исследователя.В зависимости от задачи, которая стоит перед исследователем, мембрана может быть подвергнута мягкой или жесткой обработке. При мягких условиях обработки используют как растворы с низкой ионной силой (например, 0,1-1 ММ ЭДТА, который удаляет двухвалентные катионы), так и буферы с высокой ионной силой, содержащие NACL и KCL в концентрации более 1 М, с добавлением ЭДТА или без нее. При более жесткой обработке из мембран можно удалить значительные количества белка (>50% от его общего содержания в мембранах), но, с другой стороны, такая обработка обычно приводит к денатурации, во многих случаях необратимой. В качестве примера можно привести обработку мембран 6 М гуанидинийхлоридом, 8 М мочевиной, 1 ММ п-хлормер-курибензоатом, разбавленными кислотами (РН 2,0-3,0) или щелочами (РН 9,5-11,0). Необходимо иметь в виду, что в результате удаления значительных количеств белка мембрана может морфологически измениться, в частности может произойти ее выворачивание или замыкание в везикулы.Как и в случае растворимых белков, нужно определить число и молекулярную массу полипептидных субъединиц, их стехиометрию, размер и, возможно, форму молекулы, а также, если это необходимо, биохимическую активность. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия - это обычная методика, но в случае интегральных мембранных белков при ее применении возникают особые проблемы. В этом методе додецилсульфат связывается с полипептидными цепями, и комплексы белок-ДНС разделяются в полиакриламидном геле в соответствии с их стоксовыми радиусами, которые в большинстве случаев зависят от молекулярной массы. Молекулярную массу определяют, сравнивая электрофоретическую подвижность данного комплекса и известного стандарта. Например, лактозопермеаза имеет кажущуюся молекулярную массу 33 000, если измерять ее с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН; в действительности же, как показывают результаты генетического анализа, ее молекулярная масса равна 46 000.Применение этих методов для мембранных белков может быть сопряжено с большими трудностями, вызванными связыванием детергента. Для нахождения молекулярной массы белка используют два метода. Установив относительное содержание белка и детергента в комплексе, среднее значение парциального удельного объема получают как средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента. После этого без труда находят Мк, а поскольку соотношение между белком и детергентом в комплексе известно, находят молекулярную массу белка.Метод радиационной инактивации для определения размера мишени все чаще применяется при исследовании мембранных белков. Изучать можно как очищенные белки, так и неочищенные препараты, в том числе интактные биомембраны. Суть метода состоит в определении доли белковых молекул, получающих повреждения при облучении. Образец, обычно замороженный, подвергают высокоэнергетическому облучению (например, облучают пучком электронов из синхротрона).Для определения содержания ? - спиралей и ? - слоев в мембранных белках используют несколько методов.Метод основан на измерении разности поглощения лево - и правополяризованного света; эта оптическая активность является мерой хиральности молекул, или мерой их асимметрии. В дальней ультрафиолетовой области (от 190 до 240 нм) КД определяется в основном поглощением амидов кар
3.1 Определение молекулярной массы субъединиц (электрофорез в ПААГ) 10
3.2 Определение молекулярной массы нативного белка с помощью гидродинамических методов 11
3.3 Метод радиационной инактивации 12
3.4 Спектральные методы 13
3.4.1 Метод кругового дихроизма 14
3.4.2 Инфракрасная спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния 15
3.4.3 ЯМР-спектроскопия 16
3.5 Определение ферментативной активности 16
3.6 Изучение стехиометрии субъединиц 17
3.7 Изучение трехмерной структуры с помощью рентгеновской дифракции и реконструкции изображения 18
3.7.1 Кристаллизация мембранных белков 18
3.7.2 Реконструкция изображения и двумерные кристаллы 20
4. Пример структурных исследований мембранных белков. 21
4.1 Структура поринов 21
Заключение 24
Список литературы 25
Введение
Цель работы: ознакомление с методами изучения мембранных белков.
Поставленная цель раскрывается через следующие задачи: исследовать структуру мембранных белков;
рассмотреть методы их выделения и очистки;
методы исследования характеристик мембранных белков.
Известно, что более трети структурной части генома кодирует мембранные белки, однако среди известных пространственных структур лишь менее половины процента принадлежит белкам этого класса.
При этом их роль в организме трудно переоценить. Большое количество функционально значимых белков являются мембранными: рецепторы, каналы, различные ферменты и пр. Кроме того, многие из них являются мишенями для лекарственных препаратов: более 70% существующих лекарственных средств действуют именно на мембранные белки. Таким образом, изучение механизмов функционирования мембранных белков необходимо, а одним из первых шагов к пониманию механизма является получение пространственной структуры.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
