Выбор метода формирования липосомальных контейнеров со встроенными в них полупроводниковыми наночастицами - Дипломная работа

Липосомы образованы фосфолипидами - амфифильными соединениями, молекулы которых состоят из двух частей, радикальным образом различающихся по своему отношению к водному окружению. Для определения содержания ПАУ в сточных водах в последние годы в мире большое развитие получил метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Методом озвучивание ультразвуком можно получать малые (<50 нм) одноламеллярные везикулы (МОВ). Метод пригоден для получения БОВ, состоящих из смесей фосфатидилхолина с кислым фосфоли-пидом (фосфатидилсерином) или с положительно заряженным ал-киламином, но не позволяет получать везикулы из одного фосфатидилхолина. Хотя обычно использование АСМ не позволяет получить данные о химическом составе объекта, в последнее время появились методы, позволяющие идентифицировать состав на основании данных о силовых характеристиках взаимодействия (например, метод химической силовой микроскопии).Таким образом, в процессе (рисунок 13) сканирования зонд огибает поверхность, а совокупность траекторий его перемещения повторяет рельеф поверхности выбранного участка. Эффективность контактного режима сильно ограничена возможностью механического перемещения исследуемых объектов; возможностью неконтролируемого разрушения адсорбированных слоев, зонда и/или образца; искажением данных и препятствованием сканированию поверхностными слоями, и практической невозможностью исследования поверхностей с развитым рельефом. В процессе сканирования над исследуемым участком электронная система управления поддерживает постоянным среднее расстояние между зондом и поверхностью таким, чтобы амплитуда или частота колебаний зонда сохранялась равной заданной величине. Таким образом, в формирование регистрируемой траектории сканирования основной вклад вносят адгезионные силы, величина скачка зонда к поверхности, рельеф поверхности и рельеф адсорбированных слоев. По сути своей, это задержка измеряемого сигнала, которая определяется временем, которое зонд находится в контакте с поверхностью, и, которое, очевидно, пропорционально величине силы адгезии зонда с поверхностью.Измерения образцов липосомальных контейнеров и полупроводниковых наночастиц выполнялись по следующей методике: 1) Включить все блоки измерительного комплекса; 6) Установить сканер в станину микроскопа, подключить разъемы; 17) Ввести значение скорости сканирования “Scan Speed” в линиях в секунду. Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) определялись геометрические параметры исследуемых образцов в составе сухих пленок. В таблице 9 представлены результаты определения геометрических параметров (значение высоты по Z) полупроводниковых наночастиц, липосомальных контейнеров, изготовленных методом гидратации сухой пленки и липосомальных контейнеров, изготовленных методом выпаривания в обращенной фазе.В рамках дипломной работы были решены следующие задачи: - Был проведен сравнительный анализ 8 методов формирования липосомальных контейнеров со встроенными в них полупроводниковыми наночастицами CDSE/ZNS. По результатам анализа были выбраны для исследования 2 метода изготовления липосом и встраивания в них полупроводниковых наночастиц: метод обращения фаз и метод гидратации сухой пленки. Исследование методов заключалось в измерении среднего значения диаметра липосомальных контейнеров формируемых двумя методами и определении разброса значений диаметра; Были выбраны рациональные методы и средства измерения геометрических свойств полупроводниковых частиц и липосомальных контейнеров со встроенными полупроводниковыми наночастицами.

Относительное объемное содержание частиц твердой фазы, % 1

Основными направлениями применения липосомальных контейнеров на сегодняшний день являются фармакология, медицина и косметика. Липосомы широко используются в качестве контейнеров для инкапсулирования, транспортирования и контролируемого высвобождения лекарственных препаратов и биологически активных веществ. В силу своей структурной особенности и способности к самоорганизации липосомы являются удобной системой для использования в задачах имуннохимичсекого анализа, основанного на детекции флуоресценции.

Липосомы образованы фосфолипидами - амфифильными соединениями, молекулы которых состоят из двух частей, радикальным образом различающихся по своему отношению к водному окружению. Это придает фосфолипидным молекулам свойство самопроизвольно образовывать в воде мембраны, которые представляют собой двойной слой липидных молекул, обычно называемый липидным бислоем. Строение липосомы представлено на рисунке 1.

Рис. 1. Строение липосомы

Стремление максимально ограничить контакт неполярных цепей липида с водой приводит к тому, что бислой при его достаточной протяженности замыкается сам на себя, образуя полые оболочечные структуры.

Свойства липосом определяются прежде всего наличием у них замкнутой мембранной оболочки. Несмотря на молекулярную толщину (около 4 нм), липидный бислой отличается исключительной механической прочностью и гибкостью. В жидкокристаллическом состоянии бислоя его компоненты обладают высокой молекулярной подвижностью, так что в целом мембрана ведет себя как достаточно жидкая, текучая фаза. Благодаря этому липосомы сохраняют целостность при различных повреждающих воздействиях, а их мембрана обладает способностью к самозалечиванию возникающих в ней структурных дефектов. Вместе с тем гибкость бислоя и его текучесть придают липосомам высокую пластичность. Так, липосомы меняют размеры и форму в ответ на изменение осмотической концентрации внешнего водного раствора.

Липосомы являются удобными наноконтейнерами для встраивания в них флуоресцентных наночастиц, которые используются в иммунохимических тест-система. Липосомы позволяют работать как с гидрофильными, так и с гидрофобными веществами, обладают достаточной стабильностью в водных растворах.

Иммунохимические тест-системы широко распространены в качестве инструмента для определения содержания вредных веществ (токсикантов) в продуктах питания, питьевой воде, физиологических жидкостях, тканях, природных и сточных водах.

Техногенные источники опасности в последние годы становятся более серьезными факторами экологического риска, чем природные. В Москве насчитывается более 70 химически опасных объектов. К химически опасным объектам Москвы относятся две группы предприятий. Первая группа - промышленные предприятия, на которых опасные химические вещества являются исходным сырьем, образуются на промежуточных стадиях технологических процессов, являются конечными продуктами, используются при производстве тех или иных изделий. Вторая группа - это многочисленные объекты пищевой промышленности, в которой сильнодействующие ядовитые вещества используются в холодильных установках и морозильниках (аммиак), оптовые продуктовые базы (аммиак), водоочистные станции (хлор), объекты Мосводоканала, склады и базы химических реактивов и кислот, ТЭЦ (аммиак, серная и соляная кислота), автозаправочные станции (бензин, дизельное топливо) и другие. Нужно отметить, что 50 из 70 химически опасных объектов относятся ко второй группе. Причем, объекты второй группы, как правило, располагаются обычно в черте города - в густонаселенных районах.

Среди множества токсичных веществ, образующихся при производстве энергии сжиганием ископаемых видов топлива наиболее опасными являются вещества группы ПАУ (полиароматические углеводороды). Группа ПАУ объединяет вещества, для которых характерно наличие в химической структуре трех и более конденсированных бензольных колец. Простейшие вещества из группы ПАУ - антрацен и фенантрен.

Актуальность работы

Для определения содержания ПАУ в сточных водах в последние годы в мире большое развитие получил метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Однако, несмотря на высокую точность и надежность метод ВЭЖХ обладает рядом серьезных недостатков: - Необходимость длительной пробоподготовки образцов;

- Невозможность проведения анализа вне лаборатории;

- Высокая квалификация обслуживающего персонала.

Наиболее распространенными для экспресс-анализа содержания токсичных веществ, на данный момент, являются тест-системы, аналитическим сигналом в которых является изменение цвета тестового слоя. Но данный метод не достаточно эффективен, так как является качественным и зависит от естественной окраски тестируемой жидкости.

Таким образом, важной и актуальной задачей является разработка эффективной мобильной системы для количественного определения следов ароматических и полиароматических углеводородов как маркеров загрязнения сточных вод ТЭЦ.

Флуоресцентные тест-системы пока не так распространены, но имеют больше оснований для развития, так как характеризуются высокой чувствительностью и являются менее зависимыми от естественной окраски тестируемой жидкости.

В применяемых на сегодняшний день методах анализа, основанных на люминесцентном типе детекции, применяются маркеры в виде квантовых точек (например, CDSE/ZNS). Схема подготовки образца для иммунохимического анализа с использованием квантовых точек представлена на рисунке 2. На первой стадии поверхность тестового слоя тест-системы наносятся антитела, специфичные к определяемому токсиканту. Далее, через тест-систему пропускают пробу исследуемой жидкости. В случае, если определяемый токсикант присутствует в пробе, его молекулы связываются антителами на поверхности тестового слоя. Затем через тест-систему пропускают заранее подготовленный раствор коньюгата, представляющий собой молекулярную пару определяемого токсиканта и флуоресцентной метки - квантовой точкой. В случае, если определяемый токсикант присутствует в пробе в количестве, превышающем установленный предел, связывания конъюгатов антителами на поверхности тестового слоя тест-системы не происходит. В обратном случае, антитела связываются с конъюгатами через присутствующие в их составе молекулы определяемого вещества. липосомальный контейнер полупроводниковый наночастица

Рис. 2. Принцип реализации иммунохимического определения присутствия аналита (определяемого вещества) в пробе с помощью использования квантовых точек в качестве флуоресцентной «метки»

После выполнения вышеописанных процедур поверхность тестового слоя тест-системы освещается излучением, возбуждающим флуоресценцию квантовых точек. Таким образом, интенсивность флуоресценции зависит обратно пропорционально от количества определяемого вещества в исследуемом образце.

Предельно допустимое содержание токсичных веществ ограничивает динамический диапазон изменения интенсивности флуоресценции квантовых точек в тест-системах, что требует в свою очередь применения прецизионного стационарного оборудования для количественных измерений. Для создания мобильных измерительных устройств необходимо идти также по пути увеличения чувствительности, отношения сигнал/шум тест-систем.

Перспективным способом увеличения чувствительности иммунохимических тест-систем с флуоресцентной детекцией является использование липосомальных наноконтейнеров, наполненных квантовыми точками.

Использование наноконтейнеров позволяет связать с одной молекулой определяемого токсиканта несколько люминесцентных меток, что приведет к увеличению интенсивности флуоресценции. Принцип использования наноконтейнеров для увеличения аналитического сигнала на примере липосом, наполненных квантовыми точками, приведен на рисунке 2.

Рис. 3. Принцип использования наноконтейнеров для увеличения аналитического сигнала

Постановка задачи

Известно, что спектральные характеристики квантовых точек зависят, в том числе, от их размеров. Использование квантовых точек определенного размера позволяет получать наполненные липосомальные наноконтейнеры с заданным спектром флуоресценции.

Уровень флуоресценции липосомального наноконтейнера зависит от количества встроенных в него квантовых точек. Количество квантовых точек, встроенных в липосомальный наноконтейнер, зависит, в том числе, от размера наноконтейнера и самих квантовых точек. Для обеспечения воспроизводимости измерений уровня флуоресценции при проведении иммунохимического анализа на наличие вредных веществ и определения их количества необходимо использовать методы формирования липосомальных контейнеров со встроенными наночастицами, которые дают минимальный разброс по диаметру липосом. Выбор метода формирования липосомальных контейнеров со встроенными в них полупроводниковыми наночастицами, обеспечивающего минимальный разброс значений диаметра липосомальных контейнеров. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи: - провести сравнительный анализ методов формирования липосомальных контейнеров со встроенными в них полупроводниковыми наночастицами CDSE/ZNS.

- выбрать рациональные методы и средства измерения геометрических свойств полупроводниковых наночастиц и липосомальных контейнеров со встроенными полупроводниковыми наночастицами;

- провести калибровку выбранных средств измерений;

- провести измерения геометрических свойств полупроводниковых наночастиц CDSE/ZNS;

- провести измерения геометрических свойств липосомальных контейнеров изготовленных исследуемыми методами;

2. Основная часть

2.1 Анализ методов встраивания полупроводниковых наночастиц в липосомальные контейнеры

Механизмы формирования липосомальных контейнеров со встроенными наночастицами хорошо изучены и описаны во многих статьях [13, 14, 16, 18, 21].

Ниже приведен анализ наиболее распространенных и изученных методов получения липосом, к которым относятся: - обращение фаз;

- гидратация сухой пленки;

- озвучивание ультразвуком;

- экструзия;

- инжекция;

- методы, основанные на удалении детергентов

- метод спонтанной везикуляции;

- метод «замораживания - оттаивания».

При приготовлении липосом в препаративном масштабе приходится решать немало технических вопросов, связанных с очисткой липидов, их нестабильностью, контролированием размера липосом, их агрегацией, низкой эффективностью «захвата» и т. д. Ни один из имеющихся многочисленных методов получения липосом не решает перечисленные проблемы полностью. Ниже рассмотрены относительные преимущества и недостатки указанных методов.

Методом обращения фаз можно получать мультиламеллярные везикулы (МЛВ) или гигантские (?1 мкм) одноламеллярные везикулы (ГОВ). Липиды растворяют в органическом растворителе и полученный раствор упаривают в вакууме в роторном испарителе. При этом липиды остаются на стенках колбы в виде пленки (для облегчения последующего ресуспендирования пленка должна быть возможно более тонкой). В колбу с пленкой добавляют водный буферный раствор и встряхивают ее рукой или механическим способом или же перемешивают содержимое скоростной мешалкой. Иногда встряхивание проводят в присутствии стеклянных шариков. Температура в процессе ресуспендирования всегда должна быть выше температуры фазового перехода липида. Если для приготовления липосом используют смесь липидов, температура процесса должна быть выше температуры фазового перехода наиболее высокоплавкого компонента липидной смеси. На последней стадии приготовления полученные липосомы выдерживают в водной среде в течение нескольких часов для установления равновесия.

Продолжительность и интенсивность перемешивания имеют решающее влияние на размер образующихся везикул. Для получения везикул с большим числом слоев используют либо кратковременное энергичное перемешивание («вортексирование»), либо осторожное перемешивание в течение длительного времени. В последнем случае образуются везикулы с большим внутренним объемом, чем в первом [1]. Другой способ увеличения внутреннего объема везикул состоит в том, что в состав исходной липидной смеси вводят 10 - 20% отрицательно заряженного липида.

По методу гидратации сухой пленки фосфолипиды и квантовые точки растворяют в органическом растворителе, и полученный раствор упаривают в вакууме в роторном испарителе. При этом липиды остаются на стенках колбы в виде пленки (для облегчения последующего ресуспендирования пленка должна быть как можно более тонкой). В колбу с пленкой добавляют водную фракцию и встряхивают ее рукой или механическим способом, или же перемешивают содержимое скоростной мешалкой. Иногда встряхивание проводят в присутствии стеклянных шариков. Температура в процессе ресуспендирования всегда должна быть выше температуры фазового перехода фосфолипида. Если для приготовления липосом используют смесь фосфолипидов, температура процесса должна быть выше температуры фазового перехода наиболее высокоплавкого компонента фосфолипидной смеси. На последней стадии приготовления полученные липосомы выдерживают в водной среде в течение нескольких часов для установления равновесия.

Продолжительность и интенсивность перемешивания имеют решающее влияние на размер образующихся липосом. Для получения липосом с большим числом слоев используют либо кратковременное энергичное перемешивание («вортексирование»), либо осторожное перемешивание в течение длительного времени.

Методом озвучивание ультразвуком можно получать малые (<50 нм) одноламеллярные везикулы (МОВ). Механизм этого процесса не вполне ясен. Некоторые авторы предполагают, что ультразвуковая обработка приводит к постепенному уменьшению размеров МЛВ [2], другие считают, что процесс состоит из ряда дискретных стадий [3].

Для того чтобы сократить продолжительность озвучивания, его, как правило, проводят, погружая металлический наконечник источника ультразвука непосредственно в суспензию МЛВ [4 - 7]. Многие авторы, однако, предпочитают «наружное» озвучивание с помощью соникатора «банного» типа [8]. Основные недостатки первого способа состоят в том, что он сопровождается значительным разрушением фосфолипидов и приводит к образованию аэрозолей, загрязняющих атмосферу в рабочем помещении. Загрязнения могут оказаться вредными при приготовлении липосом с использованием радиоактивных, токсичных или канцерогенных материалов. Кроме того, полученные этим способом MOB обычно содержат примеси титана и других металлов, входящих в состав наконечника, которые необходимо отделить от образца.

«Банный» способ озвучивания свободен от этих недостатков и позволяет работать с меньшими объемами суспензии МЛВ. Однако при этом удлиняется время озвучивания, а полученный препарат менее однороден и часто содержит значительные остаточные количества МЛВ.

Независимо от применяемого метода необходим тщательный контроль температуры среды во время озвучивания. Обычно стараются проводить процесс при возможно более низкой температуре, которая, однако, должна быть выше температуры фазового перехода наиболее высокоплавкого компонента смеси, так как в противном случае образуются нестабильные везикулы, мембрана которых имеет структурные дефекты. Такие дефекты удается устранить путем нагревания суспензии до температуры, превышающей температуру фазового перехода липидов. Однако при этом происходит также и слияние MOB с образованием более крупных агрегатов [9]. Прогрев препарата рекомендуется проводить всегда, независимо от температуры озвучивания, так как при этом стабильность препарата увеличивается. Однако, несмотря на все указанные меры препараты MOB, как правило, неустойчивы и медленно агрегируют.

Следует иметь в виду, что озвученные препараты MOB всегда неоднородны по размерам везикул. По мере увеличения времени озвучивания препараты становятся более однородными, однако при этом увеличивается и степень разложения фосфолипидов. Как уже упоминалось, при непродолжительном озвучивании или при использовании соникатора «банного» типа получают смеси MOB и МЛВ. Их разделение можно осуществить с помощью гель-хроматографии [6], ультрацентрифугирования [10 - 11], экструзии [12] или фильтрования через миллипорные фильтры [13].

Основной недостаток всех препаратов MOB - низкая эффективность включения (0, 1-1, 0%, или от 0, 2 до 1, 5 л на моль липида).

Все методы получения везикул, основанные на встряхивании или перемешивании, приводят к препаратам с неоднородными размерами везикул. Более однородные препараты получают с помощью экструзионного метода.

Данным методом можно получать малые одноламеллярные везикулы. По этому методу водную дисперсию МЛВ помещают в прибор с узким отверстием, так называемый пресс Френча, и подвергают быстрой экструзии при повышенном давлении. Уже при первом пассаже около 70% липида образует суспензию MOB. При вторичной экструзии выход MOB превышает 95%. Размер полученных MOB составляет 150-500 А и не зависит от температуры. Температура процесса экструзии влияет, однако, на проницаемость образующихся частиц [14, 15].

Основные преимущества метода экструзии по сравнению с ультразвуковой обработкой состоят в том, что полученные MOB не содержат частиц титана, степень перекисного окисления резко снижается и приготовление MOB не сопровождается образованием аэрозолей. Метод экструзии позволяет получить липосомальные препараты с высокой концентрацией липида и не требует концентрирования или диализа. Сообщалось также, что полученные экструзионным методом MOB более стабильны при хранении, чем MOB, приготовленные с помощью ультразвука [15].

Методом инжекции можно получать малые одноламеллярные везикулы и большие одноламеллярные везикулы (БОВ).

При приготовлении МОВ разрушения липидов и образования аэрозолей удается избежать путем впрыскивания в водную среду раствора фосфолипидов в летучем органическом растворителе с последующим упариванием растворителя [16 - 20].

Согласно первоначальному варианту этого метода [20] спиртовой раствор фосфолипидов быстро впрыскивают с помощью шприца в перемешиваемую водную среду. При достаточно быстром перемешивании и пониженном давлении спонтанно образуются MOB, напоминающие по параметрам MOB, приготовленные с помощью ультразвука. Размер везикул сильно зависит от концентрации фосфолипида и спирта. Для образования везикул с небольшим диаметром необходимо, чтобы концентрация фосфолипида не превышала 40 ММ, а конечная концентрация спирта должна быть не более 7, 5%. Хотя суммарный внутренний объем полученных липосом несколько больше, чем в случае озвученных MOB, эффективность включения остается очень низкой изза большого разбавления.

Другой недостаток инжекционного метода состоит в том, что полученные липосомы содержат некоторое остаточное количество спирта, для удаления которого препарат приходится подвергать диализу или многократному промыванию водой.

Размер и степень гетерогенности везикул, полученных методом инжекции, можно до некоторой степени варьировать путем изменения скорости впрыскивания и перемешивания, а также концентрации липида в этаноле. Ускорение впрыскивания приводит к образованию более мелких везикул [21], а при повышении концентрации фосфолипида в спирте диаметр везикул увеличивается до 1000 А и более [19].

Для объяснения этих зависимостей было предположено, что при впрыскивании этанольного раствора в воду фосфолипиды первоначально образуют мицеллы [21]. Медленная инжекция способствует образованию мицеллярных структур, которые частично захватываются формирующимися везикулами, что и приводит к образованию более крупных частиц. При предварительном добавлении спирта в среду до инжекции процесс захвата мицелл подавляется, в результате чего образуются одноламеллярные везикулы меньшего размера.

Метод этанольной инжекции может быть использован для получения БОВ при условии достаточного повышения концентрации липидов в исходном этанольном растворе [19, 22].

С помощью метода, основанного на удалении детергентов, МОВ образуются спонтанно при удалении детергента из водной смеси детергента и фосфолипидов. Для освобождения от детергента используют диализ, центрифугирование или гель-фильтрацию. Преимущество этих методов состоит в том, что они приводят к гомогенным популяциям везикул, отличающихся относительно высокой «захватывающей» способностью (степенью включения). Основной недостаток - некоторое количество детергента всегда остается в липосомах.

Диализ впервые был описан Кагава и Рэкером в 1971 году [23]. При диализе смесей, содержащих фосфолипиды, белки и холат или дезоксихолат, они наблюдали образование протеолипосом. При использовании обычных диализных мешков образующиеся липосомы неоднородны по размерам, однако при использовании специальной ячейки в контролируемых условиях позволяет получать достаточно гомогенные препараты МОВ со средним диаметром 50 нм [24]. Критическое значение для размера образующихся везикул имеет исходное соотношение фосфолипида и детергента: при избытке детергента образубтся более крупные везикулы. Также удаление детергента может быть осуществлено методами центрифугирования и гель-фильтрации.

Еще один метод удаления детергента основан на селективной адсорбции детергента в присутствии фосфолипидов [25]. Согласно этому методу дисперсию фосфолипидов в детергенте инкубируют с адсорбентом, фильтруют через стеклянную вату и осаждают образовавшиеся везикулы центрифугированием при 150000g. Остается невыясненной зависимость размера везикул от таких параметров приготовления везикул, как температура, концентрация, содержание детергента, а также остаточное содержание детергента в полученных липосомах.

Методом спонтанной везикуляции можно получать малые одноламеллярные везикулы. При быстром подщелачивании водных дисперсий, содержащих фосфатидовую кислоту или смесь фосфатидовой кислоты с фосфатидил-холином, спонтанно образуются везикулы, которые остаются стабильными при нейтральном РН [26, 27]. Полученные таким образом липосомы могут быть разделены гель-фильтрацией на фракцию MOB и фракцию, состоящую из более крупных частиц (>100 нм). Механизм этого процесса везикуляции не вполне ясен. Вероятно, он связан с ионизацией фосфатных групп, приводящей к увеличению поверхностной плотности отрицательных зарядов.

Степень везикуляции зависит от значения РН и от отношения фосфатидовая кислота/фосфатидилхолин. При увеличении этого отношения доля MOB уменьшается. Диаметр образовавшихся MOB возрастает при увеличении концентрации хлористого натрия в исходной смеси и уменьшается при увеличении значения РН и скорости процессе подщелачивания. При быстром, в течение 1 с, подщелачивании до РН 9 или выше выход MOB составляет более 70%. Выход MOB увеличивается также в присутствии хлористого натрия. Полученные этим способом из фосфатидовой кислоты MOB включают около 0, 5 л водной фазы на каждый моль фосфолипида. Фракция крупных частиц состоит в основном из больших однола-меллярных везикул.

Получение БОВ методом замораживания-оттаивания, имеющих большую захватывающую емкость, основано на быстром замораживании озвученных фосфолипидных дисперсий с последующим оттаиванием и непродолжительным вторичным озвучиванием [28]. Метод пригоден для получения БОВ, состоящих из смесей фосфатидилхолина с кислым фосфоли-пидом (фосфатидилсерином) или с положительно заряженным ал-киламином, но не позволяет получать везикулы из одного фосфатидилхолина. Полученные указанным способом препараты БОВ неоднородны по размерам (диаметр от 50 до 500 нм); внутренний объем составляет около 10 л на моль фосфолипида. В присутствии сахаров, двухвалентных катионов и в условиях высокой ионной силы эффективность захвата резко падает. На основании выполненного анализа можно сделать вывод, что наиболее подходящими методами, которые обеспечит размер формируемых липосомальных контейнеров порядка ~100 нм и минимальный разброс по диаметру являются метод гидратации сухой пленки и метод выпаривания в обращенной среде.

2.2 Выбор методов и средств измерений геометрических параметров липосомальных контейнеров и полупроводниковых наночастиц

К настоящему времени разработано большое количество аналитических методов, пригодных для выделения и характеризации наночастиц. Выбор пригодности того или иного метода определяется спецификой решаемой задачи и характером исследуемого нанообъекта и содержащей его матрицы. Ряд задач, которые требуется решить при исследовании материала, содержащего наночастицы, включает обнаружение, идентификацию, определение параметров наночастиц и их содержания в материале. Получение всей необходимой информации об объекте исследования с помощью одного метода является затруднительным, поэтому полную информацию в конечном итоге можно получить лишь с помощью правильной комбинации различных методов.

Набор характеристик выбранного метода, которые важно учитывать для решения конкретной задачи, включает в себя: предел обнаружения целевого объекта, полнота выявления, степень сохранения исходного состояния, точность измерения, универсальность подхода для анализа разных объектов, влияние мешающих факторов, таких как матричные эффекты и т.д. [1]

Микроскопические методы объединяют в своем семействе подходы, основанные на рассеянии различных типов излучений на наночастицах, а также подходы, основанные на сканирующем зондировании.

Оптическая микроскопия, в общем случае не позволяет регистрировать объекты диаметром ниже 100 нм, что определяется теоретическим пределом разрешения, связанным с минимальной длиной волны видимого света около 400 нм. Хотя существуют оптические подходы, которые позволяют разглядеть более мелкие объекты (около 50 нм), например, оптическая сканирующая микроскопия ближнего поля, чаще всего оптическая микроскопия больше подходит для анализа агрегатов, нежели отдельных наночастиц. [1, 2]

Рентгеновская микроскопия характеризуется более высокой разрешающей способностью, вследствие того, что длина волны рентгеновского излучения лежит в пределах 0, 001 -100 нм. В реальности, однако, разрешающая способность данного метода ограничивается возможностями техники фокусировки рентгеновских лучей, и составляет около 30 нм. Рентгеновские микроскопы используют отражательную или проекционную технику измерения, которые основаны соответственно на преломлении и пропускании рентгеновских лучей. Во втором случае, благодаря существованию зависимости поглощения рентгеновских лучей от типа атомов, удается получить информацию как о структуре, так и о химическом составе нанообъекта.[1]

Сканирующая конфокальная лазерная микроскопия является менее распространенным методом в практике анализа наночастиц. Связано это, прежде всего, с возможностью определения таким способом только флуоресцирующих наночастиц (к таковым можно отнести, например, квантовые точки). Данный тип микроскопии обладает возможностью анализа наночастиц в объеме материала, а не только на его поверхности, что определяет особое место сканирующей конфокальной лазерной микроскопии в ряду микроскопических техник.

Электронная микроскопия наиболее часто используется для анализа наноматериалов благодаря высокой разрешающей способности, возможности анализа большого круга нанообъектов, а также широкому диапазону определяемых концентраций наночастиц (1-100 мг/л). Электронная микроскопия подразделяется на сканирующую электронную микроскопию(СЭМ), основанную на рассеянии электронов на поверхности образца с последующей их фокусировкой, и просвечивающую электронную микроскопию(ПЭМ), основанную на пропускании фокусированного потока электронов через образец. Благодаря высокой разрешающей способности электронная микроскопия позволяет визуализировать наночастицы диаметром до субнанометрового и характеризовать их по размеру и форме частиц, оценивать степень дисперсности, агрегации и концентрацию в образце. Данный метод позволяет детектировать наночастицы в сложных матрицах, например, в продуктах питания; водных, воздушных и почвенных пробах; в биологических объектах: тканях и органах, клетках, биологических жидкостях.

Дополнение электронной микроскопии такими методами как спектроскопия характеристических потерь энергии электронов, или методом локальной дифракции электронов позволяет значительно расширить возможности, получая, например информацию о кристаллической структуре наночастиц.

Отдельным преимуществом ПЭМ является возможность анализа всего объема препарата, что позволяет проводить подсчет количества частиц точнее, чем при сканировании поверхности.

К основным недостаткам метода следует отнести прежде всего возможность анализа только электронно-плотных материалов, вследствие чего электронная микроскопия плохо применима для анализа объектов, состоящих из легких атомов (1-3 периоды таблицы Менделеева), в том числе углерода. Это ограничение исключает возможность анализа большого класса важных технологических наночастиц, таких как нанотрубки, фуллерены и др. Еще одним важным недостатком метода является значительный матричный эффект. Поэтому результаты анализа и возникновение различных артефактов в значительной степени зависят от способа и условий пробоподготовки, которая зачастую является сложным продолжительным процессом. Кроме того, во время пробоподготовки образца для электронной микроскопии могут индуцироваться процессы, влияющие на состояние нанообъектов, которые отсутствуют в исходном материале, например, агглютинация частиц. Дополнительные проблемы возникают при анализе наночастиц в биоматериале. Так электронно-плотные частицы оксида титана на электронных микрофотографиях сходны с гранулами гликогена и рибосомами, а частицы полистирола - с везикулами.

Характеристика наночастиц в «естественной» среде проводится с применением других методов, например, таких как сканирующая электронная микроскопия в естественной среде (ЕСЭМ).

Особенностью метода является то, что электронная пушка и фокусирующие линзы микроскопа находятся в глубоком вакууме, а ячейка с образцом изолирована от других частей прибора. В таком случае анализируемый образец находится в исходном окружении. Это дает ЕСЭМ два основных преимущества: возможность характеристики аналита в гидратированном состоянии и отсутствие необходимости фиксации и контрастирования исследуемого объекта. ЕСЭМ, как и традиционную СЭМ, можно совмещать с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией с помощью применения специальной приставки. К недостаткам ЕСЭМ можно отнести то, что анализу подвергается лишь приповерхностный слой образца, а разрешающая способность метода уменьшается до ~ 100 нм. Таким образом, метод применим скорее к анализу агрегатов, нежели отдельных наночастиц.[1, 3, 4]

Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) объединяет такие методы как атомно-силовая, сканирующая туннельная, магнитно-силовая, фрикционно-силовая, сканирующая тепловая микроскопии и сканирующая микроскопия ионной проводимости.

Для анализа наноматериалов из них наиболее часто применяется атомно-силовая микроскопия (АСМ). В АСМ измеряются слабые (от пико-до наноньютонов) силы ван-дер-ваальсового взаимодействия между острием (кантилевером) и поверхностью сканируемого материала, и, таким образом, вырисовывается рельеф поверхности образца. Разрешающая способность такого сканирования при этом может достигать нескольких ангстремов, и лимитируется размерами острия кантилевера. Отметим, что при этом определяемые АСМ размеры поверхностных объектов оказываются несколько большими, чем реальные. АСМ дает возможность визуализации частиц в естественной среде, предоставляя трехмерную информацию об объекте, в отличие от таких методов как ПЭМ, которые позволяют получать лишь двумерную проекцию изображения. Приготовление твердых образцов для АСМ, как и для ПЭМ, проводится с использованием техники получения ультратонких срезов на микротоме. Применяются также методы химического травления поверхности полученного среза. Объем анализируемого материала при использовании техники срезов минимален, поэтому вероятность обнаружения наночастиц в таком случае значительно ниже, чем при приготовлении образца из жидкого материала. Методы сканирующей микроскопии обладают рядом преимуществ по сравнению с электронной микроскопией, прежде всего связанных с возможностью анализа не только электронно-плотных объектов и способностью визуализации трехмерного рельефа поверхности. В то же время сканирующие методы уступают ПЭМ по возможности обнаружения и визуализации частиц в толще образца, а также по площади обзора (на 3-4 порядка). Кроме того, взаимодействие зонда и образца зачастую порождает комплекс факторов, искажающих реальную картину и затрудняющих корректную интерпретацию данных.

Хотя обычно использование АСМ не позволяет получить данные о химическом составе объекта, в последнее время появились методы, позволяющие идентифицировать состав на основании данных о силовых характеристиках взаимодействия (например, метод химической силовой микроскопии). АСМ в режиме электросиловой микроскопии значительно расширяет возможности определения наночастиц в сложных матриксах.

Сущность метода заключается в обнаружении отличий в диэлектрических свойствах наночастиц и их окружения. При этом поверхность сканируется в двух режимах: в стандартном режиме для визуализации профиля поверхности и электросиловом режиме, при котором кантилевер, на который подается постоянное напряжение, проходит на заданном уровне над образцом для создания карты изменения электрических свойств поверхности. Наибольшую информацию дает измерение фазы колебания кантилевера. Полученная карта используется в качестве «маски», которая затем используется для отсечения объектов отличающихся по фазе колебания кантилевера от соответствующего значения, характерного для конкретного вида наночастиц. Наложение «маски» на топографический профиль позволяет обнаружить искомые наночастицы.

Кроме АСМ другим часто используемым вариантом СЗМ является сканирующая туннельная микроскопия (СТМ), основанная на детектировании электронов, проходящих через зазор между острием зонда, находящегося под напряжением, и сканируемой поверхностью. Поскольку вероятность прохождения электронов через потенциальный барьер зависит не только от величины зазора, но и от химического состава поверхности, СТМ позволяет получать информацию об электрических свойствах материала. Разрешающая способность метода составляет около 1 нм. Меньшая распространенность СТМ по сравнению с АСМ в области анализа объектов, содержащих наночастицы, связана с тем, то СТМ применима только для анализа токопроводящих материалов - металлов или полупроводников.[1, 5]

Методы рассеяния излучения, применяемые для анализа наночастиц, включают в себя динамическое лазерное светорассеяние, малоугловое рассеяние нейтронов и малоугловое рассеяние рентгеновских лучей.

Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС) позволяет установить гидродинамический радиус частиц и степень их агрегации. Одно из достоинств ДЛС - быстрота получения результата (несколько минут). Использование в данном методе трансмиссионных решеток и одновременной регистрации рассеянного и дифрагированного света позволяет уменьшить влияние шума на автокорреляционную кривую в 20 - 30 раз. Поскольку в рассеяние света вносят вклад любые частицы и макромолекулы в растворе, при анализе смесей, содержащих частицы с широким разбросом по размерам, возникают значительные трудности, поэтому ДЛС часто совмещают с различными методами разделения частиц. [1, 6]

Применяются также и методы гидролитического разрушения макромолекул.

Метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МРР) позволяет детектировать неоднородности вещества, размер которых существенно превышает длину волны излучения (0, 01 - 1 нм). Эффект малоуглового рассеяния рентгеновских лучей возникает при наличии в системе равномерно распределенных неоднородностей размером 1 - 100 нм. Данный метод является весьма информативным, пос

В рамках дипломной работы были решены следующие задачи: - Был проведен сравнительный анализ 8 методов формирования липосомальных контейнеров со встроенными в них полупроводниковыми наночастицами CDSE/ZNS. По результатам анализа были выбраны для исследования 2 метода изготовления липосом и встраивания в них полупроводниковых наночастиц: метод обращения фаз и метод гидратации сухой пленки. Исследование методов заключалось в измерении среднего значения диаметра липосомальных контейнеров формируемых двумя методами и определении разброса значений диаметра;

- Были выбраны рациональные методы и средства измерения геометрических свойств полупроводниковых частиц и липосомальных контейнеров со встроенными полупроводниковыми наночастицами. Для измерения полупроводниковых наночастиц рациональными методами являются АСМ и ДРС, для измерения липосомальных контейнеров;

- В целях обеспечения единства измерений была проведена калибровка выбранных средств измерений;

- Были проведены измерения геометрических свойств полупроводниковых наночастиц CDSE/ZNS. Среднее значение диаметра полупроводниковых наночастиц измеренных методами АСМ составило 10 нм с неопределенностью ±1, 8 нм. Среднее значение диаметра полупроводниковых наночастиц измеренных методами ДРС составило 8 нм;

- Были проведены измерения геометрических свойств липосомальных контейнеров изготовленных исследуемыми методами. Среднее значение диаметр липосомальных контейнеров, изготовленные методом гидратации сухой пленки составил 90 нм с разбросом по диаметру - ±10 нм. Среднее значение диаметра липосомальных контейнеров, изготовленных методом выпаривания в обращенной фазе составил 95 нм с разбросом по диаметру - ±30 нм.

На основании измерений липосомальных контейнеров можно сделать вывод, что метод гидратации сухой пленки обеспечивает минимальный разброс значений диаметра.

1. В. Л. Миронов «Основы сканирующей зондовой микроскопии». Учебное пособие для студентов старших курсов высших учебных заведений;

2. Нагорнов Ю.С., Ясников И.С., Тюрьков М.Н. «Способы исследования поверхности методами атомно-силовой и электронной микроскопии». Учебное пособие;

3. А.Г. Сергеев «Нанометрология», 2011г;

4. А.Г.Дивин, С.В. Пономарев «Методы и средства измерений, испытаний и контроля»

5. Учебно-методические материалы Института биохимии им. А.Н.Баха РАН: «Сравнительный анализ методов выделения, очистки, идентификации и определения содержания ТНЧ в биоматериале, используемых в отечественной и зарубежной практике, в том числе методов, разрабатываемых в проектах Рамочных программ ЕС и рекомендуемых нормативами Европейского Союза.»;

6. Douglas B. Murphy, Michael W. Davidson FUNDAMENTALS OF LIGHT MICROSCOPY AND ELECTRONIC IMAGING A JOHN WILEY & SONS, INC., 2012;

7. Stephen J. Pennycook Peter D. Nellist Scanning Transmission Electron Microscopy. Imaging and Analysis, Springer, 2011;

8 Williams, David B., Carter, C. Barry Transmission Electron Microscopy, Springer, 2009;

9. Yi Zhang , Jun Hu , Xudong Xiao The Application of STM and AFM in Nanoprocess and Fabrication, Microsystems and Nanotechnology , 2012;

10. A. S. Kozlov , A. K. Petrov , N. A. Vinokurov Study of nanoobjects of different nature using submillimeter laser ablation Optoelectronics, Instrumentation and Data Processing , Volume 47, Issue 4 , 2011;

11. Lakowicz, Joseph R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd edition, Springer, 2006.

12. Безруков Д.А., канд.дисс.: Технологии получения комбинированных липосомальных препаратов доксорубицина, МИТХТ им.М.В.Ломоносова, 2007.

13. Olson F., Hunt C.A., Szoka F.C. et al. Preparation of liposome of defined size distribution by extrusions through polycarbonate membranes. - Biochim. et Biophys. acta, 1979, vol. 557, p.9-23.

14. Биотехнология получения лекарственных и иммуногенных липосомальных композиций, используемых в лечении экспериментальных особо опасных инфекций и получении сырья для производства медицинских иммунобиологических препаратов. Таран Татьяна Викторовна, диссертация... доктора медицинских наук; ГОУВПО "Ставропольский государственный университет"], Ставрополь, 2004

15 Evaluation of the high-pressure extrusion technique as a method for sizing plasmid DNA-containing cationic liposomes.Carstens MG , van der Maaden K , van der Velden D , Ottenhoff TH , Melief CJ , Ossendorp F , Bouwstra JA , Jiskoot W ., J Liposome Res., 2011

16.Berden J.A., Barker R.W., Radda G.K. NMR studies on phospholipids bilayers: some factors affecting lipid distribution. - Biochim. et Biophys. acta, 1975, vol. 375, p.186-208.

17.Hauser H.O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. - Biochim. and Biophys. Res. Communs, 1971, vol. 45, p.1049-1055

18. Huang C. Studies on phosphatidylcholine vesicles: Formation and physical characteristics. - Biochemistry, 1969, vol. 8, p. 344-359

19.Papahadjopoulos D., Watkins J.C. Phospholipid model membranes. ll. Permeability properties of hydrated liquid crystals. Biochim. et Biophys. acta, 1967, vol. 135, p.639-652

20Lawaczek K., Kainosho M., Chan S.J. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. - Biochim. et Biophys. acta, 1976, vol. 43, p.313-330

21.Roseman M., Litman B.J., Thompson T.E. Transbilayer exchange of phosphatidylethanolamine for phosphatidylcholine and N-acetimidoylphosphatidylethabolamine in single-walled bilayer vesicles. - Biochemistry, 1975, vol. 14, p.4826-4830

22.Watts A., Marsh D., Knowles P.E. Characterization of dymiristoylphosphatidylcholine vesicles and their dimensional changes through the phase transition: molecular control of membrane morphology. - Biochemistry, 1978, vol. 17, p.1792-1801

23.Ohno M., Sakai T., Tsuchida E. et al. Interaction of human erythrocyte ghosts or liposomes with polyethylene glycol detected by fluorescence polarization. - Biochim. and Biophys. Res. Communs, 1981, vol. 102, p.426-431

24.Dearden S.J., Hunter T.F., Philp J. A rapid method for the preparation of microvesicles of egg yolk lecithin. - Biochim. et Biophys. acta, 1982, vol. 689, p.415-418

25.Kremer J.M.H., Esker M.W.J., Pathmamanoharan C., Wiersema P.H. Vesicles of variable diameter prepared by a modified injection method. - Biochemistry, 1977, vol. 16, p.3933-3935

26.Schieren H., Rudolph S., Finkelstein M. et al. Comparison of large unilamellar vesicles prepared by a pethroleum ether vaporization method with multilamellar vesicles. - Biochim. et Biophys. acta, 1979, vol. 572, p.137-153

27. Липосомы в биологических системах. Под редакцией Г.Грегориадиса, А.Аллисона, Москва, «Медицина», 1983

28. Измерение размеров наночастиц методом динамического рассеяния света, Т.Н. Лупанова ЦКП ИБГ РАН Методическое пособие Москва 2013г;

29. Huang C. Studies on phosphatidylcholine vesicles: Formation and physical characteristics. - Biochemistry, 1969, vol. 8, p. 344-359;

30. Метрологическое обеспечение нанотехнологий и продукции наноиндустрии. Под ред. В.Н.Крутикова. Учебное пособие. Москва «Логос», 2011г.

Размещено на .ru