Вплив івермектину та його аналогів на функціональні властивості мембран зародків в’юна - Автореферат

Біологічні мембрани відіграють важливу роль у підтриманні іонного гомеостазу клітини (Антонов, 1997), беруть участь у регуляції клітинних поділів, проліферації клітин та розвитку організму в цілому (Веренинов, Марохова, 1986; Husain et al., 1997), вони також є центром морфогенетичних процесів раннього розвитку ембріонів (Гойда, 1993). Зміни біоелектричних параметрів зародкових клітин у значній мірі залежить від властивостей самої мембрани (Божкова, 1986; Божкова и др., 1974) та від функціонування іонтранспортних систем, для таких іонів як Na , K , Ca2 , Cl-. Відома здатність івермектину інгібувати АТФ-залежний транспорт іонів Na , K у нематод Onchocerca volvulus (Shu et al., 2000) та Ca2 у клітинах SH-SY5Y клітинної лінії людської нейробластоми (Bultynck et al., 2001), у мязах та мікросомальній фракції мозку кроля (Bilmen et al., 2002). Мембрана є першим барєром для проникнення речовин у клітину і саме на мембрані розташовані багаточисленні рецептори, які приймають зовнішні сигнали. Дисертаційну роботу виконано відповідно до тематики наукових досліджень Львівського національного університету імені Івана Франка як складову частину таких науково-дослідних держбюджетних тем: “Еволюція іонтранспортних систем в період раннього розвитку зародків риб”, № держреєстрації 0105U002210 (2005-2006 рр.), “Гідробіоценози заповідних та антропогеннозмінених територій західноукраїнської частини Головного європейського вододілу”, № держреєстрації 0107U002055 (2007 р.), “Антиоксидантна і транспортні системи мембран зародків холоднокровних за дії лазерного випромінювання”, № держреєстрації 0108U004148 (2008-2009 рр.), а також гранту Президента України для підтримання наукових досліджень молодих учених “Динаміка активності мембранних АТФАЗ зародків риб”, № держреєстрації 0107U010322 (2007 р.).Для електронно-мікроскопічних досліджень зародки на стадіях 2 бластомерів та на 6 годині розвитку (10 поділ бластомерів), які знаходились у середовищі з додаванням відповідних концентрацій авермектинів, фіксували впродовж години 1,5% розчином глутарового альдегіду в 0,2 моль какодилатному буфері (РН 7,2; t= ЧОС). Криві залежності функціонування Na , К -АТФАЗИ від рівня АТФ у середовищі інкубації дещо відмінна на досліджуваних стадіях розвитку зародків: спостерігається стрімке зростання її активності з підвищенням концентрації АТФ до 1,5 ммоль, вихід на плато (2, 16, 64 бластомерів) та подальше збільшення в діапазоні 2,0-3,0 ммоль (8-10 поділи бластомерів). Однак на стадіях 16, 64 бластомерів та стадії 10 поділу Катф близькі за значеннями (?2,7 ммоль) до тих, які характерні для низькоафінних центрів ферменту Са2 -АТФАЗ ПМ клітин печінки щурів (Pavoine et al., 1987). На стадії 2 бластомерів оуабаїнчутлива Атфазна активність за наявності авермектину в усьому досліджуваному діапазоні концентрацій зазнавала найменших змін у порівнянні з іншими стадіями, активність зменшувалась в середньому на 22,7±0,3 % (p>0,99) у порівнянні з контролем на цій стадії. За наявності у середовищі інкубації івермектину у діапазоні концентрацій 0,01?1 мкг/мл спостерігали наявність коливань, які характеризуються зниженням активності ферменту на стадіях 16 та 64 бластомерів і наростанням на стадії 8 поділу бластомерів з незначним зниженням на стадії 10 поділу.У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань проведено дослідження впливу авермектинів на функціонування Na , K -та Са2 -помп зародків вюна Misgurnus fossilis L., а також зясовано ймовірні механізми їх впливу на іонтранспортні системи зародків, та наслідки їх впливу на морфогенетичному та клітинному рівні. Визначено кінетичні характеристики Na , K -АТФАЗНОЇ активності ПМ зародків вюна Misgurnus fossilis L. упродовж раннього ембріогенезу, показано наявність центрів різної спорідненості до АТФ, які змінюються впродовж синхронних поділів. Авермектин та івермектин у діапазоні концентрацій (0,001-10 мкг/мл) за умов проведення досліджень in vitro та (0,01-1 мкг/мл) in vivo дозозалежно інгібують оуабаїнчутливу АТФАЗУ зародкових мембран у порівнянні з контролем. Значення констант напівінгібування І50 свідчать про те, що зміни Na , K -АТФАЗНОЇ активності повязані з різним ступенем чутливості даної АТФАЗИ до дії авермектинів та умовами проведення досліджень. Інгібіторний аналіз дії івермектину на Na , K -АТФАЗУ показав наявність умовно конкурентного типу інгібування, який може здійснюватись за механізмом звязування івермектину та авермектину з молекулами Na , K -АТФАЗИ, з подальшою зміною конформації і затриманням ферментів у стані Е1 та зміною ліпідного оточення, характерною для клітин у стані активного поділу.

Основний зміст роботи

У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань проведено дослідження впливу авермектинів на функціонування Na , K - та Са2 -помп зародків вюна Misgurnus fossilis L., а також зясовано ймовірні механізми їх впливу на іонтранспортні системи зародків, та наслідки їх впливу на морфогенетичному та клітинному рівні.

Визначено кінетичні характеристики Na , K -АТФАЗНОЇ активності ПМ зародків вюна Misgurnus fossilis L. упродовж раннього ембріогенезу, показано наявність центрів різної спорідненості до АТФ, які змінюються впродовж синхронних поділів. Розраховано максимальну швидкість та константи Міхаеліса-Ментен для реакції гідролізу АТФ на кожній з досліджуваних стадій розвитку.

Авермектин та івермектин у діапазоні концентрацій (0,001-10 мкг/мл) за умов проведення досліджень in vitro та (0,01-1 мкг/мл) in vivo дозозалежно інгібують оуабаїнчутливу АТФАЗУ зародкових мембран у порівнянні з контролем. Значення констант напівінгібування І50 свідчать про те, що зміни Na , K -АТФАЗНОЇ активності повязані з різним ступенем чутливості даної АТФАЗИ до дії авермектинів та умовами проведення досліджень.

Авермектини у концентрації 0,1 та 1 мкг/мл інгібують сумарну Са2 , Mg2 -АТФАЗНУ активність. Ступінь інгібування, якої залежить від умов проведення дослідження та стадії розвитку. Найбільш чутливою до дії препаратів є остання стадія синхронних поділів за умов проведення дослідження in vivo.

Інгібіторний аналіз дії івермектину на Na , K -АТФАЗУ показав наявність умовно конкурентного типу інгібування, який може здійснюватись за механізмом звязування івермектину та авермектину з молекулами Na , K -АТФАЗИ, з подальшою зміною конформації і затриманням ферментів у стані Е1 та зміною ліпідного оточення, характерною для клітин у стані активного поділу.

Дисперсійний аналіз впливу концентрації препаратів та фактору часу на зміни активності Na , K -АТФАЗИ зародків встановив, що їхній внесок у мінливість активності мембранного ферменту є більш істотним на стадії 8 поділу і дещо знижується на стадії 10 поділу бластомерів.

Зміни у динаміці коливань ТМП зародків вюна протягом синхронних поділів вказують на зменшення абсолютних значень ТМП, які свідчать про зниження в основному активності Na , K -АТФАЗИ, а також ймовірної зміни іонної проникності мембран бластомерів. Збільшення періоду коливань та порушення синхронності коливань вказують на сповільнення процесів розвитку зародків.

Морфологічні зміни свідчать про високу чутливість організмів зі слабкою системою захисту. За дії авермектинів у зародків виявлено такі аномалії: відставання у розвитку, деформацію кісток скелету, затримку та аномалії у закладанні серцево-судинної системи, недорозвинення зябер та плавців.

Електронно-мікроскопічне дослідження ультраструктури бластомерів зародків на першій годині розвитку при дії авермектинів виявило суттєві пошкодження мембранних органел зародкових клітин. На першу годину розвитку відмічено ознаки некрозу клітин і значну вакуоляризацію клітинного вмісту при наявності препаратів у інкубаційному середовищі у концентрації 1 мкг/мл. На шостій годині розвитку зафіксовано протеоліз та ділянки некрозу за дії івермектину у концентрації 0,1 мкг/мл.

Отримані результати дають підставу вважати, що дія авермектинів на зародки вюна Misgurnus fossilis L. здійснюється через дестабілізацію структур і функцій мембран та інгібування ферментативної активності системи активного транспорту іонів (Na , K , Са2 ), які у свою чергу запускають механізми некротичної загибелі клітин.

1. Зміни морфологічного розвитку зародків та личинок вюна Misgurnus fossilis L. за умов впливу івермектину / С.М. Мандзинець, М.В. Целевич, Д.І. Санагурський, Д.В. Янович // Науковий Вісник львівської національної академії ветеринарної медицини імені с.з. ґжицького. - 2006. - Т.8, №2 (29). - С. 91-95.

2. Зміна ферментативної активності Na , K -помпи зародків риб за умов впливу івермектину / Мандзинець С.М., Целевич., М.В., Янович Д.В., Санагурський Д.І. // Біологія тварин. - 2006. - Т 9, № 1-2. - С. 217-221.

3. Мандзинець С. Властивості макроциклічних лактонів як модуляторів мембранних структур / С. Мандзинець // Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. - 2008. - Вип. 46. - С. 13-32.

4. Целевич М.В. Кінетичні характеристики Na , K -АТФАЗИ клітин зародків вюна / М.В. Целевич, С.М. Мандзинець, Д.І. Санагурський // Вісник Харків. ун-ту ім. В. Н. Каразіна. - 2008. - Т. 1, № 20. - С. 29-36.

5. Мандзинець С.М. Аналіз впливу двох макроциклічних лактонів на активність Na , K - залежної, Mg2 -активованої АТФАЗИ зародків вюна / С.М. Мандзинець, М.В. Целевич, Д.І. Санагурський // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2008. - № 3. - С. 19-24.

6. Мандзинець С.М., Целевич М.В., Янович Д.В., Санагурський Д.І. Вплив івермектину на Na , K -АТФАЗНУ активність зародків риб: збірник тез IV зїзд Українського біофізичного товариства (Донецьк, 19-21 грудня, 2006 р.). - С. 70-71

7. Мандзинец С.М., Целевич М.В., Янович Д.В., Санагурский Д.И. Константы ингибирования Na , K -ATP-азы зародышей вьюна авермектинами: Сб. тезисов 11-ой Пущинской межд. школы-конференции мол. ученых: [БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА] (Пущино, 29 октября - 2 ноября, 2007 г.). - Пущино, 2007. - 12 с. - Режим доступу до тез: http://www.biology21.ru/downloads/Biology21Thesis2007.pdf

8. Mandzynets S.M., Tselevych M.V., Yanovich D.V. Sanagurski D.I. Ivermectin is as modulator of the activity of the Na,K-ATPASE of loach embryos during early embryogenesis: abstracts 6th Parnas Conference [Molecular mechanism of cellular signaling], (Krakow, Poland, May 30 - June 02, 2007). - Krakow, Poland, 2007 - 22 p.

9. Мандзинец С.М., Целевич М.В., Санагурский Д. И. Влияние ивермектина на активность Na , K -активированой, Mg2 -зависимой АТФАЗЫ зародышей вьюна in vitro и in vivo: Сборник. ст. в 2-х частях. Первая часть. [“Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: Межд. науч. Конф.; Восьмой съезд Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков”], (Минск, 25-27 июня 2008 г) / Под. редакцией: И.Д. Волотовского и др. - Минск: 2008 г. - 392 с.

10. Мандзинец С.М., Целевич М.В. Особенности кинетики Na ,K -активированного, Mg2 -зависимого гидролиза АТФ зародышевыми клетками вьюна: Материалы докл. XV межд. конф. студ., асп. и мол. ученых “Ломоносов” / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев. [Электронный ресурс] - М.: Издательство МГУ; СП МЫСЛЬ, 2008. - 1 электрон. опт. диск (CD-ROM); 12 см. - Систем. требования: ПК с процессором 486 ; Windows 95; дисковод CD-ROM; Adobe Acrobat Reader. - 17 с. - Режим доступу до тез: 11. http://www.lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2008/02_1.pdf

12. Mandzynets S.M., Tselevych M.V., Sanagursky D.I. Avermectins: concentration-dependent effects on adenosine triphosphatase in loach embryos of M. fossilis L. during early development: [Biologycal motility: achievements and perspectives] / Eds . Z.A. Podlubnaya, S.L. Malyshev. - Pshchino: Foton-Vek, 2008. - Vol.1. - P. 162-163.

13. Мандзинець С.М. Комплексний вплив авермектинів на іонтранспортні системи зародків Misgurnus fossilis впродовж раннього ембріогенезу: збірник тез міжнар. наук. конф. присв. 70-річчю від дня народження проф. О.А. Гойди [“Біофізичні механізми функціонування живих систем”] (Львів, 16-18 жовтня 2008 року). - Львів, 2008. - 61-62 с.

14. Мандзинец С.М., Целевич М.В., Янович Д.В., Санагурский Д.И. Влияние авермектинов на сумарную Са2 -АТФАЗНУЮ активность мембран зродышей вьюна Misgurnus fossilis L.: Сб. тезисов 12-ой Пущинской межд. школы-конференции мол. учених [БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА], (Пущино, 10 - 14 ноября, 2008 года).- Пущино, 2008. - 178 с. - Режим доступу до тез: 15. http://www.biology21.ru/index.php?option=com_content&task=view&id=46&Itemid=55

16. Мандзинець С.М., Целевич М.В., Санагурський Д.І. Зміни динаміки трансмембранного потенціалу зародків вюна упродовж раннього ембріогенезу за умов впливу івермектину: Матеріали ІІІ міжн. конф. мол. учених [“Біологія: від молекули до біосфери”], (Харків 18-21 листопада 2008 р.). - Харків, 2008. - 75 с.