Вплив температури та складу середовища на фетальний гемоглобін і гемоглобін донорської крові - Автореферат

Будова молекули гемоглобіну змінюється у процесі онтогенеза, але, незалежно від типу і періоду синтезу, більшість молекул гемоглобіну мають по два однакових поліпептидних ланцюга. В останній ембріональний період життя після двох місяців гестації відбувається переважно синтез g-ланцюгів, внаслідок чого переважає фетальний гемоглобін (гемоглобін F) (Карлсон Б., 1983). Особливістю фетального гемоглобіну є те, що він в порівнянні з гемоглобіном А в фізіологічних умовах володіє підвищеною спорідненістю до кисню. Успішні результати застосування фетальних еритроцитів і розчинів фетального гемоглобіну завдяки вираженому антигипоксичному ефекту в експериментальних дослідженнях (Антоненко В.Т., 1979, 1980) обумовили необхідність тривалого зберігання гемоглобінів кордової крові. Мета дослідження - визначити, як впливає заморожування-відтавання і склад середовища на конформаційний і функціональний стан гемоглобінів А і F людини.Використовували оксигемоглобін А людини (HBA), виділений з свіжої донорської крові і очищений методом гель-хроматографії; фетальний гемоглобін (HBF), виділений з кордової крові за допомогою денатурації гемоглобіну А і осадження його сульфатом амонію, і очищення методом гель-хроматографії. Температурно-пертурбаційною диференціальною спектрофотометрією в ультрафіолетовій області оцінювали конформацію білків при дослідженні впливу температури в інтервалі 10? 38°С на фетальний гемоглобін і гемоглобін А до і після заморожування-відтавання. Заморожування-відтавання розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну приводить до конформаційних змін в молекулах цих білків. Крім того, в процесі заморожування гемоглобіну А і фетального гемоглобіну утворюються умови, які сприяють окисленню заліза в гемоглобіні, котрі, можливо, викликані концентрованим сольовим розчином. При фракціонуванні розчинів гемоглобіну А і F в 1,9М натрію хлориду положення максимумів для гемоглобіну А не змінюється, в той час як для гемоглобіну F зсувається й відповідає фракції з молекулярною масою 36 КД (рис.2).Методами ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії і гель-хроматографії показано, що фетальний гемоглобін є менш стійким до дії розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М - дисоціація цього білка починається при менших концентраціях солі у порівнянні з гемоглобіном А. Одержані в роботі результати можуть враховуватися при розробці методів збереження розчинів гемоглобінів кордової крові, скоректованих з врахуванням особливостей фетального гемоглобіну в меншій стійкості, в порівнянні з гемоглобіном А, до дії пошкоджуючих факторів при заморожуванні-відтаванні. (Дисертантом виконані експерименти з порівняльного вивчення впливу розчинів хлориду натрію на гемоглобіни А і F, проведена статистична обробка даних та проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз перших похідних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну; Моісеєвим В.О. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Хромушкіним К.М. одержано біологічний матеріал для дослідження, виконано теоретичний аналіз одержаних результатів). (Дисертантом виконані експерименти з вивчення конформації гемоглобінів А і F після заморожування-відтавання в розчинах гліцерину і 1,2-ПД, статистично оброблені та проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз диференціальних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну з кріопротекторами; Кучеренко Ю.В. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів). 68-71.(Дисертантом виконані експерименти з вивчення впливу заморожування-відтавання на структурно-функціональний стан гемоглобінів А і F, проведена статистична обробка даних і проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз перших похідних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну; Кучеренко Ю.В. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Леоновим Б.М. виконані розрахунки вмісту різних форм гемоглобіну в розчинах).

Основний зміст роботи

1. Успішні результати застосування фетальних еритроцитів і розчинів фетального гемоглобіну в експериментальних дослідженнях обумовили необхідність тривалого зберігання еритроцитів і гемоглобінів кордової крові. Практично не вивчений вплив факторів низькотемпературного консервування на гемоглобін F. У звязку з цим в роботі було визначено, як впливає заморожування-відтавання і склад середовища на конформаційний і функціональний стан гемоглобінів А і F людини.

2. Заморожування-відтавання гемоглобінів А і F приводить до зміни конформації цих білків, що показано методом ультрафіолетової спектрофотометрії, і до зміни функціонального стану гемоглобінів А і F - підвищення вмісту метгемоглобіну.

3. Методами ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії і гель-хроматографії показано, що фетальний гемоглобін є менш стійким до дії розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М - дисоціація цього білка починається при менших концентраціях солі у порівнянні з гемоглобіном А.

4. Методом сольвентно-пертурбаційної диференціальної спектрофотометрії встановлено, що гліцерин і 1,2-ПД в області концентрацій 10?40% не впливають на конформацію фетального гемоглобіну до заморожування-відтавання. В присутності 10% и 40% розчинів ПЕГ-1500 відбувається агрегація макромолекул, причому фетальний гемоглобін агрегує в меншій мірі, ніж гемоглобін А.

5. Визначено, що заморожування-відтавання в присутності 10?40% розчинів гліцерину дозволяє зберегти конформацію гемоглобіну А і фетального гемоглобіну незмінною. Розчини 1,2-ПД концентрацією 10?40% дозволяють зберегти незмінною конформацію гемоглобіну А при заморожуванні-відтаванні, в той час як гемоглобін F зазнає конформаційних змін.

6. Кінетика взаємодії фетального гемоглобіну з модельними ліпосомальними мембранами, сформованими з фосфатидилхоліну і кардіоліпіну, не відрізняється від кінетики взаємодії гемоглобіну А з мембранами. Заморожування-відтавання не впливає на неї.

7. Одержані в роботі результати можуть враховуватися при розробці методів збереження розчинів гемоглобінів кордової крові, скоректованих з врахуванням особливостей фетального гемоглобіну в меншій стійкості, в порівнянні з гемоглобіном А, до дії пошкоджуючих факторів при заморожуванні-відтаванні.

Перелік опублікованих робіт

1. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Моисеев В.А., Хромушкин К.Н. Изучение влияния концентрированных растворов натрия хлорида на состояние фетального гемоглобина и гемоглобина А // Біофізичний вісник. 2001. №2 (9). С. 64-66. (Дисертантом виконані експерименти з порівняльного вивчення впливу розчинів хлориду натрію на гемоглобіни А і F, проведена статистична обробка даних та проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз перших похідних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну; Моісеєвим В.О. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Хромушкіним К.М. одержано біологічний матеріал для дослідження, виконано теоретичний аналіз одержаних результатів).

2. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Кучеренко Ю.В. Спектральные свойства фетального гемоглобина после замораживания-оттаивания в растворах глицерина и 1,2-пропандиола // Проблемы криобиологии. 2001. №4. С. 73-74. (Дисертантом виконані експерименти з вивчення конформації гемоглобінів А і F після заморожування-відтавання в розчинах гліцерину і 1,2-ПД, статистично оброблені та проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз диференціальних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну з кріопротекторами; Кучеренко Ю.В. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів).

3. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Кучеренко Ю.В., Леонов Б.Н. Аутоокисление гемоглобинов А и F после замораживания-оттаивания // Проблемы криобиологии. 2002. №4. С. 68-71.(Дисертантом виконані експерименти з вивчення впливу заморожування-відтавання на структурно-функціональний стан гемоглобінів А і F, проведена статистична обробка даних і проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз перших похідних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну; Кучеренко Ю.В. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Леоновим Б.М. виконані розрахунки вмісту різних форм гемоглобіну в розчинах).

4. Тимченко Н.Н. Влияние заморажиания-оттаивания на конформацию фетального гемоглобина и взаимодействие его с липосомами // Проблемы криобиологии. 2003. № 2. С. 104-108.

5. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Моисеев В.А., Хромушкин К.Н. Сравнительное изучение влияния замораживания-оттаивания на гемоглобины А и F // Проблемы криобиологии. Тезисы докладов Всеукраинской научной конференции “Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины”. 2001. №3. С. 20. (Дисертантом виконане порівняльне вивчення впливу заморожування-відтавання в розчинах, що містять різні концентрації хлориду натрію, на гемоглобіни А і F; статистично оброблені та проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконані розрахунки вмісту різних форм гемоглобіну в розчинах; Моісеєвим В.О. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Хромушкіним К.М. одержано біологічний матеріал для досліджень, виконано теоретичний аналіз одержаних результатів).

6. Онищенко Е.В., Тимченко Н.Н. Влияние низких температур, глицерина и 1,2-пропандиола на термоденатурацию фетального гемоглобина// Проблемы криобиологии. Тезисы докладов конференции молодых ученых ИПКИК НАН Украины. 2002. №1. С. 113-114. (Дисертантом приготовлені зразки для експериментів та оброблені і проаналізовані отримані результати; Оніщенко О.В. виконані експерименти з дослідження впливу низьких температур, гліцерину і 1,2-пропандіолу на термоденатурацію фетального гемоглобіну).

7. Морозова Т.Ф., Дюбко Т.С., Тимченко Н.Н. Температурная лабильность белковой части и гема гемоглобина человека после охлаждения до температуры -196?С // Материалы V съезда белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков “Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем”. Минск, Беларусь. 2002. С. Т-82. (Дисертантом був виділений і очищений гемоглобін для дослідження, проведені спектральні вимірювання, статистична обробка спектральних даних, теоретичний аналіз одержаних результатів; Морозовою Т.Ф. виконане теоретичне узагальнення експериментального матеріалу; Дюбко Т.С. виконано розрахунок вмісту різних форм гемоглобіну в розчині і аналіз перших похідних спектрів поглинання гемоглобіну).

8. Morozova T.F., Rozanova E.D., Dyubko T.S., Timchenko N.N. Low temperature influence on donor blood hemoglobin // 14th Meeting of the European Association for Red Cell Research. Roskoff, France. 2003. P. 8. (Дисертантом був виділений і очищений гемоглобін для дослідження, проведені спектральні вимірювання, статистична обробка спектральних даних, теоретичний аналіз одержаних результатів; Морозовою Т.Ф. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Розановою К.Д, виконані розрахунки вмісту різних форм гемоглобіну в розчині; Дюбко Т.С. виконано аналіз перших похідних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну).