Вплив низьких температур і кріопротекторів на структурний стан мікросомальних мембран - Автореферат

Дія низьких температур призводить до порушення ліпід-білкових і ліпід-ліпідних взаємодій у мембранах [Белоус А. М. та ін., 1982], до просторового перерозподілу білків, порушення їх третинної і четвертинної структури [Луговий В. І., 1981], агрегації з утворенням S-S зшивок [Levitt J.A., 1982], дисоціації ліпопротеїнових комплексів. Вивчення структурно-функціональних особливостей мікросомальних мембран і впливу на них різних фізико-хімічних факторів, повязаних з процесом кріоконсервування біологічних систем, є актуальним для кріобіології, оскільки ендоплазматичний ретікулум є структурою, що поєднує частини клітини в цілістну систему. Однак механізм впливу озону на мембрани, що є первинною мішенню впливу озону на клітини, багато в чому залишається остаточно не зясованим. Робота виконана в межах планових відомчих НДР в ІПКІК НАН України: “Дослідження можливих механізмів профілактичного і терапевтичного впливу озону і перекису водню, які генеруються в газовому розряді при використанні в акушерстві, гінекології, а також як стимуляторів метаболічних процесів у біологічних обєктах після кріоконсервування“, № держ. реєстрації 0102U002025, “Підвищення ефективності технологій кріоконсервування біологічних систем шляхом інтенсифікації репараційних процесів після дії холоду і зниження ризику мікробної контамінації на різних етапах кріоконсервування“ (№ держ. реєстрації 0105U03918). У звязку з зазначеною вище метою стояли наступні задачі: - дослідити вплив низькомолекулярних проникаючих кріопротекторів гліцерину (Гл), 1,2-пропандіолу (1,2-ПД) і диметилсульфоксиду (ДМСО), низьких температур і озону на структурний стан мікросомальних білків та ліпідів методами спектрофотометрії і спектрофлуориметрії, - дослідити зміни термостабільності мікросомальних білків у присутності кріопротекторів до і після низькотемпературного впливу та після дії малих доз озону, - визначити вплив Гл, ДМСО і 1,2-ПД, низьких температур та озону на перебіг перекисних процесів у мікросомальних мембранах печінки щурів методом хемілюмінесценції.Для дослідження зворотності структурних змін мікросомальних мембран під дією кріопротекторів суспензію мікросом відмивали від кріопротекторів. Введення дозованих кількостей озону в суспензію мікросом здійснювали шляхом змішування суспензії з фізіологічним розчином, що містив розчинений озон у концентрації до 4 мг/л (0,02?0,79 МКМ О3/мг білку). Графіки СПДС будували як залежність від концентрації кріопротекторів відношення різниці значень СПДС у максимумі спектрів поглинання (на довжині хвилі 270 нм) мікросом у присутності кріопротекторов і значень СПДС у максимумі спектрів поглинання мікросом без кріопротекторов (А270-А0270) до відповідного значення у максимумі спектра поглинання мікросом без кріопротектора (А0270). На підставі аналізу отриманих спектрів показано, що після охолодження суспензії мікросом без кріопротекторів на фоні деякого підвищення загальної інтенсивності спектра спостерігаються зрушення близько 1 нм (р<0,01) як основного мінімуму 1ПСП, так і окремих смуг зі зміною співвідношення їх інтенсивностей. Охолодження і наступний нагрів суспензії мікросом у присутності кріопротекторів посилюють ступінь дії кріопротекторів на мікросомальні мембрани.В дисертації представлено теоретичне і експериментальне узагальнення наукової проблеми, націленої на дослідження дії Гл, 1,2-ПД і ДМСО, охолодження-нагріву та озону на структурні перебудови мікросомальних мембран. Експериментально показано, що в присутності Гл, 1,2-ПД і ДМСО відбуваються зміни конформації білків мікросомальних мембран, змінюється мікрооточення білків; Гл, 1,2-ПД і ДМСО змінюють структуру мікросомальних мембран, утворюючи водневі звязки з білками мікросом, і змінюють доступність білків мікросом розчинникові; за ступенем впливу на мікросомальні мембрани кріопротектори можна розташувати в ряд ДМСО > 1,2-ПД > Гл. % впливають на стан ліпідного бішару мікросомальних мембран, викликаючи збільшення полярності ліпідного бішару, що пояснюється зростанням вмісту води в бішарі; охолодження-нагрів підсилює дестабілізуючу дію кріопротекторів на ліпідний бішар. % відбувається посилення процесів перекисного окиснення мікросомальних мембран, що може бути обумовлено порушенням їх структури. Процесс охолодження-нагріву мікросомальних мембран посилює вплив кріопротекторів на конформаційний стан мікросомальних білків та на процеси ПОЛ.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В дисертації представлено теоретичне і експериментальне узагальнення наукової проблеми, націленої на дослідження дії Гл, 1,2-ПД і ДМСО, охолодження-нагріву та озону на структурні перебудови мікросомальних мембран.

1. Експериментально показано, що в присутності Гл, 1,2-ПД і ДМСО відбуваються зміни конформації білків мікросомальних мембран, змінюється мікрооточення білків; Гл, 1,2-ПД і ДМСО змінюють структуру мікросомальних мембран, утворюючи водневі звязки з білками мікросом, і змінюють доступність білків мікросом розчинникові; за ступенем впливу на мікросомальні мембрани кріопротектори можна розташувати в ряд ДМСО > 1,2-ПД > Гл.

2. При застосуванні Гл, 1,2-ПД і ДМСО як кріозахисних речовин їх бажано застосовувати у концентраціях, які не перевищують: ДМСО - 10 мас. %, 1,2-ПД - 20 мас. % і Гл - 30 мас. % з метою кращого збереження мембранних структур.

3. Гл, 1,2-ПД і ДМСО в концентраціях 20-40 мас. % впливають на стан ліпідного бішару мікросомальних мембран, викликаючи збільшення полярності ліпідного бішару, що пояснюється зростанням вмісту води в бішарі; охолодження-нагрів підсилює дестабілізуючу дію кріопротекторів на ліпідний бішар.

4. Показано, що при додаванні Гл, 1,2-ПД і ДМСО в концентраціях 30-40 мас. % відбувається посилення процесів перекисного окиснення мікросомальних мембран, що може бути обумовлено порушенням їх структури.

5. Процесс охолодження-нагріву мікросомальних мембран посилює вплив кріопротекторів на конформаційний стан мікросомальних білків та на процеси ПОЛ.

6. Встановлено, що озон впливає на конформаційний стан білків мікросом, і зокрема гему цитохрому Р-450, причому істотні зміни відбуваються при дозах озону вище 1,5 мг/л.

7. Показано, що озон в дозах 2,5-4,0 мг/л призводить до посилення активності процесів перекисного окиснення в мікросомальных мембранах внаслідок прискорення процесів ліпопероксидації і паралельного сповільнення окиснення продуктів ПОЛ. Озон у дозах 0,5 - 1,5 мг/л сповільнює процеси ПОЛ в мембранах мікросом. Використання останньої властивості малих доз озону може бути рекомендовано для розробки способів покращення збереження біологічних обєктів у процесі їх кріоконсервування.

1. Онищенко Е.В., Зинченко А.В. Исследование влияния некоторых проникающих криопротекторов на белки микросом методом хемилюминесценции // Проблемы криобиологии.- 2005.- Т.15.- №1.- С.50-55.

2. Онищенко Е.В., Дюбко Т.С. Влияние замораживания на белки микросом в присутствии низкомолекулярных криопротекторов по данным УФ-спектрофотометрии // Проблемы криобиологии.- 2005.- Т.15.- №2.- С.184-194.

3. Зинченко А.В., Онищенко Е.В. Термоденатурация микросомальных белков в присутствии глицерина, 1,2-пропандиола и диметилсульфоксида // Проблемы криобиологии.- 2005.- Т.15.- №3.- С.316-319.

4. Онищенко Е.В., Дюбко Т.С., Зинченко А.В. Спектрофотометрическое исследование влияния некоторых проникающих криопротекторов на белки микросом // Вісник Харк. ун-ту.- 2004.- №637. Біофізичний вісник.- Вип.1-2 (14).- С.105-111.

5. Онищенко Е.В., Дюбко Т.С., Семенченко А.Ю. Влияние низкомолекулярных криопротекторов и замораживания на флуоресцентные свойства микросомальных белков // Актуальные проблемы медицины и биологии.-Сб. науч. работ. Киев: КНМУ, 2004. - №1.- С. 106-117.

6. Onischenko E., Djubko T., Zinchenko A. Study of low temperature effect on rat liver microsomes using spectrofluorimetry // Proc. Internat. Conf. Criobiomol. - 2003. Low temperature biology, Coimbra - Portugal. 14-18 sept. 2003.- Р.24-25.

7. Онищенко Е.В., Зинченко А.В. Влияние диметилсульфоксида на состояние белков микросомальных мембран // Тези доповідей 1 Укр. наук.конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики”, ХНУ, Харків, Україна, 20-22 вер. 2004 р.- С.137.

8. Онищенко Е.В., Дюбко Т.С., Зинченко В.Д., Зинченко А.В. Влияние озона на компоненты микросомальных мембран // Сборник научных трудов IV Укр. научно-практ. конф. “Совр. аспекты применения озона в медицине и экологии“, Вестник физиологии и курортологии.- 2005.- №5.- С.30-31.

9. Мусина И.А., Белых И.А., Онищенко Е.В., Зинченко В.Д., Дюбко Т.С. Исследование влияния озона на биологические системы методами оптической спектроскопии // Тези доповідей 5 Харк. конф. мол. наук. “Радіофізика та НВЧ електроніка“, 14-16 грудня 2005 р., Харків.- С.51.