Вплив лектинів на спонтанний та індукований мутагенез у Bacillus subtilis - Автореферат

Лектини володіють широким спектром біологічної активності, що дає підстави до застосування їх у різних галузях біології і медицини. Перспектива використання лектинів у медицині та фармакології висуває на перший план задачу дослідження мутагенних та антимутагенних властивостей цих речовин. Захист геному передбачає досконале розуміння закономірностей і механізмів впливу на мутаційний процес та можливість керувати цим процесом. Відповідно до мети було поставлено такі завдання: дослідити вплив лектинів на спонтанний мутаційний процес, використовуючи мутанти B. subtilis, дефектні за генами системи репарації/рекомбінації; Встановлено, що визначальними факторами при здійснені модулюючого ефекту лектинів на мутаційний процес є: генотип rec-мутанта B. subtilis (нормальна, чи пошкоджена система репарації/ рекомбінації, молекулярна структура лектину, тип мутації та механізм дії мутагену при індукованому мутагенезі.Вперше, з використанням мутантів B. subtilis, що мають пошкодження в системі репарації/рекомбінації, знайдено умови, за яких дані білки виявляють генопротекторну і антимутагенну дію, та показано участь власного лектину B. subtilis в реалізації такої дії. Експериментально одержано характеристики умов максимального прояву протекторної і антимутагенної дії лектинів: відсутність глюкози у складі бактеріального середовища, концентраційні співвідношення лектин/мутаген (ефективні концентрації лектинів знаходяться у діапазоні від 1,0 до 100,0 мкг/мл), черговість їх внесення в тест-систему (попередня обробка лектином). Визначено лектини, представники різних структурних класів, які є ефективними протекторами щодо генотоксичної дії іонів Ni(II) у тест-системі B. subtilis: CONA, LAA, PHA-P, PHA-L, STA, SNA, HPA, ЛБЧ-1 та лектин B. subtilis. Встановлено, що модулюючий ефект лектинів на мутаційний процес залежить від таких факторів: відсутності (rec ), чи наявноті (rec-) дефекту в системі репарації/рекомбінації мутанта B. subtilis; структури молекули лектину; типу мутації (точкові та інсерційні), механізму дії мутагену при індукованому мутагенезі (однониткові розриви, зшивки, алкілування ДНК). Встановлено, що при наявності мутації у гені RECP (штам RECP149 B. subtilis) втрачається здатність до продукування позаклітинного сіалоспецифічного лектину B. subtilis, який аглютинує еритроцити кроля.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Робота відноситься до малодослідженої проблеми - вивчення впливу лектинів на мутаційний процес. Отримані результати доводять здатність лектинів до модулюючого впливу на процес спонтанного та індукованого мутагенезу. Вперше, з використанням мутантів B. subtilis, що мають пошкодження в системі репарації/рекомбінації, знайдено умови, за яких дані білки виявляють генопротекторну і антимутагенну дію, та показано участь власного лектину B. subtilis в реалізації такої дії.

1. Розроблено схему тестування модулюючої дії лектинів на спонтанний та індукований мутаційний процес, де задіяні мутанти B. subtilis, дефектні за ключовими ланками системи репарації/рекомбінації/реплікації: RECA, RECB, RECE, RECF, RECG, RECH, RECL, RECM, RECP, add-5, POLC. Експериментально одержано характеристики умов максимального прояву протекторної і антимутагенної дії лектинів: відсутність глюкози у складі бактеріального середовища, концентраційні співвідношення лектин/мутаген (ефективні концентрації лектинів знаходяться у діапазоні від 1,0 до 100,0 мкг/мл), черговість їх внесення в тест-систему (попередня обробка лектином).

2. Визначено лектини, представники різних структурних класів, які є ефективними протекторами щодо генотоксичної дії іонів Ni(II) у тест-системі B. subtilis: CONA, LAA, PHA-P, PHA-L, STA, SNA, HPA, ЛБЧ-1 та лектин B. subtilis.

3. Встановлено, що модулюючий ефект лектинів на мутаційний процес залежить від таких факторів: відсутності (rec ), чи наявноті (rec-) дефекту в системі репарації/рекомбінації мутанта B. subtilis; структури молекули лектину; типу мутації (точкові та інсерційні), механізму дії мутагену при індукованому мутагенезі (однониткові розриви, зшивки, алкілування ДНК).

4. Показано, що ізоформи РНА-L та РНА-Е комерційного препарату лектину квасолі звичайної (РНА), а також дві ізоформи ЛБЧ-1 та ЛБЧ-2 (S. nigra), виділені за допомогою методу ізоелектрофокусування, котрі мають різні фізико-хімічні характеристики, діють на мутаційний процес по-різному. Достовірний протекторний та антимутагенний ефект здійснюють ізоформи РНА-L та ЛБЧ-1. Це свідчить про доцільність виявлення серед спектру ізоформ лектинів такої ізоформи, у якої є протекторні та антимутагенні властивості.

5. Встановлено, що при наявності мутації у гені RECP (штам RECP149 B. subtilis) втрачається здатність до продукування позаклітинного сіалоспецифічного лектину B. subtilis, який аглютинує еритроцити кроля.

6. Визначено, що ключову роль в реалізації модулюючого впливу рослинних лектинів на мутаційний процес у B. subtilis відіграє сіалоспецифічний лектин, за відсутності якого бактеріальна клітина втрачає здатність реагувати на дію чужорідних лектинів.

7. Показано вплив лектинів на процеси реплікації та транскрипції in vivo, виявлений шляхом використання метаболічних інгібіторів, які діють на різні клітинні мішені (матричний синтез ДНК, транскрипція, синтез пептидоглікану клітинної стінки, біосинтез білка), а також синтетичних аналогів азотистих основ - похідних феназину.

8. Встановлено у системі транскрипції in vitro із залученням РНК-полімерази фага Т7, що клітинною мішенню дії власного сіалоспецифічного лектину B. subtilis є ДНК-залежний синтез РНК.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Карпова И.С., Корецкая Н.В., Тихонова Т.Н., Пидпала О.В., Лукаш Л.Л. Влияние изолектинов Phaseolus vulgaris на спонтанный мутагенез у rec и rec- мутантов Bacillus subtilis // Біополімери і клітина. -2001. -Т.17, №5. - C. 406-410. Особистий внесок здобувача - участь у виконанні експерименту, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

2. Корецька Н.В., Кочубей Т.О. Карпова І.С. Дослідження звязку між структурою та біологічною активністю ізолектинів квасолі звичайної (Phaseolus vulgaris) з використ. різних тест-систем // Вісник Київського університету. Серія "Біологія". -2002. Випуск 36. - C. 40-43. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні та виконанні експериментів, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

3. Карпова І.С., Корецька Н.В. Дослідження модифікуючого впливу лектинів на токсичність і мутагенність іонів Ni(II) в культурі Bacillus subtilis // Біополімери і клітина. -2003. -Т.19, №3. - С.224-230. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні та виконанні експериментів, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

4. Карпова І.С., Коваленко Е.О., Корецька Н.В., Гетьман К.І. Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів // Біополімери і клітина. -2004. -Т.20, №4. - С. 290-295. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні та виконанні експериментів, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

5. Підгорський В.С., Карпова І.С., Коваленко Е.О., Корецька Н.В., Гетьман К.І., Римар С.Ю. Участь лектинів сапрофітних бактерій Bacillus subtilis у репаративних процесах // Доповіді НАН України. -2005. - №1. - С. 154-158. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні та виконанні експериментів, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

6. Карпова І.С., Корецька Н.В., Кочубей Т.О. Здатність лектинів модулювати дію антибіотиків на ріст мутантів Bacillus subtilis // Укр. біохім. журн. -2005. -Т.77, №3. - С. 136-141. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні та виконанні експериментів, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

7. Карпова І.С., Коваленко Е.О., Корецька Н.В. Гетьман К.І. Дослідження здатності екзолектину Bacillus subtilis модулювати дію антибіотиків на ріст мутантів B. subtilis // Мікробіологічний журн. -2006. -Т.68, № 4. - С. 40-47. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні та виконанні експериментів, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

8. Карпова І.С., Корецька Н.В., Лялюцька Т.С. Розвиток ідей С.М. Гершензона у дослідженні адаптивності мутацій // Физиология и биохимия культурных растений. -2006. -Т.38, №2. - С. 124-133. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні та виконанні експериментів, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

9. Карпова І.С., Пальчиковська Л.Г, Корецька Н.В., Платонов М.О., Коваленко Е.О., Гетьман К.І. Лектини модулюють цитостатичну дію композитних біорегуляторів - конюгатів аза-аналогів піримідину та феназин-1-карбонової кислоти в тест-системі Bacillus subtilis // Укр. біохім. журн. -2006. -Т.78, №5. - С. 93-100. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні дослідження, виконанні експериментів in vivo, підготовці препаратів для експериментів in vitro, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

10. Карпова И.С., Корецкая Н.В. Модулирующее влияние лектинов на мутагенез у Bacillus subtilis опосредовано системой репарации // Збірник наук. праць "Фактори експериментальної еволюції організмів". -Київ. Аграрна наука. -2004. -Т.2. - С. 294-299. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні та виконанні експериментів, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

11. Карпова І.С., Корецька Н.В. Дослідження антимутагенної дії лектину суцвіть бузини з використанням rec- мутантів Bacillus subtilis // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. -2005. -Т.3, №1-2. - С. 57-64. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні та виконанні експериментів, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

12. Карпова І.С., Корецька Н.В. Вплив лектинів на частоту спонтанного ревертування мутантів Bacillus subtilis, одержаних за дії гетерологічної ДНК // Збірник наук. праць "Фактори експериментальної еволюції організмів".-Київ. Логос. -2006. -Т.3. - С. 349-353. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні та виконанні експериментів, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

13. Карпова І.С., Корецька Н.В. Модулююча дія рослинних лектинів на мутагенний ефект іонів Ni(II) залежить від стану репаративної системи тест-обєкту Bacillus subtilis // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. -2006. - Т.5, №2. - С. 85-89. Особистий внесок здобувача - участь у плануванні та виконанні експериментів, статистичній обробці, аналізі результатів, підготовці матеріалів до друку.

14. Karpova I.S., Koretskaya N.V. Some properties of lectins from Sambucus nigra inflorescences // INTERLEC19. Fortaleza, Brazil, 2001. - P. 42.

15. Kovalenko E.A, Karpova I.S., Koretskaya N.V., Getman E.I. Effects of lectins on the genotoxicity of Ni(II) ions for Bacillus subtilis // INTERLEC 20. Copenhagen, Denmark, 2002.- P. 7.

16. Karpova I.S. Koretskaya N.V., Kochubey T.O. Lectins as modulators of Ni(II) induced genotoxicity and mutagenesis in rec and rec- strains of Bacillus subtilis // 32nd Annual Meeting of Europian environmental mutagen society. Warsaw, Polan, 2002. - P. 173.

17. Karpova I.S., Palchikovskaya L.I., Koretskaya N.V., Platonov M.O., Alexeeva I.V. Stady of the combined effects of lectins and inhibitors of nucleic acid biosyntesis on microbial growth // 4th Parnas Conference. Wroclaw, Poland, 2002. - Р. 66.

18. Карпова І.С., Корецька Н.В., Пальчиковська Л.Г., Платонов М.О., Алексеєва І.В. Сумісна дія лектинів та інгібіторів матричних процесів на ріст мутантів Bacillus subtilis з нормальною та пошкодженою системою репарації // Матеріали VIII Українського біохімічного зїзду. Чернівці, 2002. - C.34.

19. Карпова І.С., Коваленко Е.О., Корецька Н.В., Гетьман К.І. Вплив лектинів на репаративні процеси // Установчий зїзд Українського товариства клітинної біології. Львів, 2004. - С.258.

20. Кочубей Т.О., Карпова І.С., Корецька Н.В. Дослідження сумісної дії лектинів та антибіотиків в тест-системі сапрофітної бактерії Bacillus subtilis // Матеріали конференції "Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2004". Київ, 2004. - С. 17.

21. Коваленко Е.О., Карпова І.С., Корецька Н.В., Гетьман К.І. Дослідження сумісної дії екзолектину Bacillus subtilis та антибіотиків // Матеріали Х зїзду Товариства мікробіологів України. Одеса, 2004. - С.57.

22. Карпова И.С., Лукаш Л.Л., Корецкая Н.В. Лектин из соцветий Sambucus nigra может модулировать мутагенез в соматических клетках млекопитающихся in vitro и клетках бактерий // Материалы Международного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва, 2004. - С. 461.

23. Карпова И.С., Коваленко Э.А., Пальчиковская Л.И., Корецкая Н.В., Платонов М.О., Гетьман Е.И., Сащук Е.В. Исследование возможных механизмов действия лектина Bacillus subtilis с использованием композитных биорегуляторов - производных феназин-1-карбоновой кислоты // Матеріали міжнародної конеренції "Мікробні біотехнології ". Одеса, 2006. - С. 29.