Вплив кріопротекторів та заморожування-відігріву на клітини кісткового мозку собак - Автореферат

Найбільш ефективним способом зберігання кісткового мозку єзявлятися,являтися низькотемпературне консервування [Останков М.В. Цим зумовлена необхідність дослідження впливу кріопротекторів і заморожування-відігріву на кістковий мозок найбільш поширених домашніх тварин - собак, а також розробка технології довгострокового зберігання кісткового мозку цього виду тварин. Це має важливе значення для визначення збереження і прогнозування життєздатності кісткового мозку тварин після кріоконсервування, що є основою для створення технології довгострокового зберігання кісткового мозку собак і використання його у ветеринарній практиці. Дослідити вміст фосфоліпідів в клітинах кісткового мозку собак після кріоконсервування. Визначити рівень основних субстратів та метаболітів внутрішньоклітинних енергетичних процесів (глікоген, аденозин-3-фосфат (АТФ), глюкозо-6-фосфат (Г-6-Ф), піруват (ПВК), молочна кислота) в клітинах кісткового мозку собак після дії кріопротекторів і заморожування-відігріву.Матеріалом дослідження був кістковий мозок, отриманий методом кістковомозкової пункції [Kushida T. et al., 2000; Kushida T. et al., 2002] із стегнових кісток статевозрілих собак (самців 3 - 4 років). Аналіз мієлограм проводили на мазках суспензії клітин кісткового мозку, фіксованих і забарвлених азур ІІ - еозином згідно з методикою Романовського-Гимза [Бейер В.А., 1973], в світловому мікроскопі (обєктив - 100, окуляр - 10) оцінювали якісний склад кісткового мозку. При цитохімічних дослідженнях в світловому мікроскопі підраховували по 100 клітин кожної групи клітин кісткового мозку собак і в кожній з клітин визначали інтенсивність забарвлення. Відомо [Останкова Л.В., 1973; Willhite D.H., Katz P.I., 1984; Fuller B.J., 2004], що кріопротектори, які використовуються для зниження негативних ефектів заморожування-відігріву, самі можуть впливати на клітини при експозиції до заморожування. З метою успішної мієлотрансплантації важливо зберегти не тільки не лише клітини, здатні до проліферації і диференціювання, але і весь клітинний спектр кісткового мозку на стабільному рівні.Вивчення дії заморожування-відігріву на клітини кісткового мозку і їх біохімічний потенціал є актуальним, зважаючи на необхідність розвитку методів кріоконсервування кісткового мозку і застосування його у ветеринарній практиці. У дисертаційній роботі досліджено дію різних концентрацій кріопротекторів і низькотемпературної консервації на збереження, морфологічні й біохімічні показники клітин, що дає змогу визначити підходи для розробки технології довгострокового зберігання кісткового мозку собак. Гліцерин надає недостатньо високий рівень захисту клітин кісткового мозку собак при кріоконсервуванні, що складає від 50% до 60% від показників контролю. Заморожування-відігрів клітин кісткового мозку собак призводить до зменшення рівня фосфоліпідів мембран. Заморожування-відігрів без кріопротектора призводить до зменшення рівня енергетичних субстратів в клітинах кісткового мозку собак.

Основний зміст роботи

Вивчення дії заморожування-відігріву на клітини кісткового мозку і їх біохімічний потенціал є актуальним, зважаючи на необхідність розвитку методів кріоконсервування кісткового мозку і застосування його у ветеринарній практиці. У дисертаційній роботі досліджено дію різних концентрацій кріопротекторів і низькотемпературної консервації на збереження, морфологічні й біохімічні показники клітин, що дає змогу визначити підходи для розробки технології довгострокового зберігання кісткового мозку собак.

1. Показано, що після заморожування-відігріву кісткового мозку собак без кріопротектора зберігається лише незначна кількість бластів, лімфоцитів та гранулоцитів, що становить менш ніж 6% від показників контролю.

2. Встановлено, що ДМСО в 7%, 10% концентрації та ПЕО-400 в 10% і 15% концентрації забезпечують збереження близько 80% всіх видів клітин кісткового мозку собак після заморожування-відігріву. Гліцерин надає недостатньо високий рівень захисту клітин кісткового мозку собак при кріоконсервуванні, що складає від 50% до 60% від показників контролю.

3. Найбільш стійкими до кріоконсервування у присутності кріопротекторів (ДМСО, ПЕО-400, гліцерину) є клітини кісткового мозку, що знаходяться на ранніх стадіях розвитку. Найбільш чутливі - зрілі клітини, а з них гранулоцити та мегакаріоцити.

4. Заморожування-відігрів клітин кісткового мозку собак призводить до зменшення рівня фосфоліпідів мембран. Використання кріопротектора ДМСО перешкоджає цім змінам та зберігає показники на рівні контроля, ПЕО-400 та гліцерин були менш ефективними. виказані,висловлені

5. Заморожування-відігрів без кріопротектора призводить до зменшення рівня енергетичних субстратів в клітинах кісткового мозку собак. Кріоконсервування клітин кісткового мозку собак з ДМСО 7% концентрації зберігає запас глікогену, рівень АТФ, глюкозо-6-фосфату і пірувату на значеннях, близьких до контрольних.

Перелік опублікованих робіт

1. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Цитохимическое выявление фосфолипидов в гематопоэтических клетках костного мозга собак после замораживания в жидком азоте // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, №3.- С. 581-586.

2. Водопянова Л.А., Жегунов Г. Ф. Зміни показників мієлограми собак до та після кріоконсервування у рідкому азоті // Біологія тварин - 2005. - Т.7, № 1-2.- С. 245-250.

3. Водопьянова Л.А., Жегунов Г. Ф. Сохранность клеток костного мозга собак после экспозиции с криопротекторами и замораживания в жидком азоте // Проблемы криобиологии. - 2006. - Т. 16, №2. - С. 207-210.

4. Водопьянова Л.А. Содержание ПВК и лактата в клетках костного мозга собак при криоконсервировании // Вісник проблем біології і медицини. - 2006. - Вип. 4. - С. 10-14.

5. Водопянова Л.А., Жегунов Г. Ф. Цитохімічне дослідження глікогену в клітинах кісткового мозку собак після заморозки у рідкому азоті // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць. - Біла Церква, 2006. - Вид. 36. - С. 226-233.

6. Водопянова Л.А., Жегунов Г. Ф. Цитохімічне виявлення глікогену у клітинах кісткового мозку собак після кріоконсервування у рідкому азоті // Матеріали II Міжнародної наукової конференції „Молодь та поступ біології”. - Львів. - 2006. - С.414.

7. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Криоконсервирование клеток костного мозга собак под защитой проникающих и непроникающих криопротекторов // Материалы ежегодной конференции молодых ученых «Холод в биологии и медицине -2006» - Харьков.- 2006. - С. 26.

8. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Влияние криопротекторов и замораживания в жидком азоте на сохранность клеток костного мозга собак // Матеріали 10ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Россия, г. Пущино. - 2006 г. - С.71.

9.Gennadiy F. Zhegunov, Larisa A. Vodopyanova Cytochemical revealing of phospholipids in canine bone marrow cells after cryopreservation in liquid nitrogen // Материалы конференции «Cryo 2006» - Hamburg. - 2006. - Р. 99.

10. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Цитохимическое выявление фосфолипидов в клетках костного мозга собак после криоконсервирования в жидком азоте // Материалы IX съезда Украинского биохимического общества. - Харьков. - 2006. - С. 169-170.

11. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Содержание АТФ и глюкозо-6-фосфата в клетках костного мозга собак после криоконсервирования // Український біохімічний журнал. - 2007. - Т. 79, №3. - С. 101-104.

12. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Влияние криоконсервирования на содержание АТФ в клетках костного мозга собак // Материалы V Международного симпозиума «Актуальные проблемы биофизической медицины». Институт физиологии им. А.А. Богомольца. - Киев. - 2007. - С. 40.

13. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Кріоконсервування клітин кісткового мозку собак під захистом кріопротекторів // Матеріали міжнародної научно-практичній конференції молодих вчених и спеціалістів «Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики». Львівська національна академія ветеринарної медицини ім.. С.З. Гжицького. - Львів. - 2007. - С. 21-24.

14. Larisa Vodopyanova, Olga Denysova. Research of dogs` bone marrow cell safety after cryopreservation in liquid nitrogen // Матеріали конференції молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології і генетики присвячена 120-річчю М.І. Вавилова. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України. - Київ. - 2007. - С. 114.