Вплив кріопротекторів і низьких температур на термодинамічні параметри та структурний стан компонентів кордової крові і плаценти людини - Автореферат

Різні біологічні обєкти вимагають індивідуального підходу при розробці технології низькотемпературного консервування (концентрація і вид кріопротектора, режими еквілібрації з кріопротектором, охолодження, нагрівання і т.д.) (Н.С.Пушкарь і співавт., 1981; А.М.Белоус і співавт.,1994). Оскільки модифікація структурних елементів клітин відбувається ще на етапі їх підготовки до кріоконсервування (Л.Г.Кулешова, 1999; Н.Г.Землянских і співавт., 2005), то порівняльне дослідження впливу на клітини різних кріопротекторів і режимів еквілібрації в кріозахисних середовищах мають безпосередній звязок з проблемою кріоконсервування еритроцитів КК. Таким чином, комплексні експериментальні дослідження впливу кріопротекторів на низькотемпературні фазові переходи і склування, а також на структурний стан еритроцитів КК є актуальними і мають як теоретичне, так практичне значення. Метою роботи було встановлення закономірностей впливу проникних кріопротекторів і низьких температур на фазовий та структурний стан компонентів кордової крові, а також динаміки насичення плаценти кріопротекторами. Дослідити вплив 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), гліцерину (Гл) і ДМСО на температуру фазових переходів і склування в еритроцитах, в плазмі КК і в плаценті.Час еквілібрації зразків плаценти в розчинах 1.2-ПД і Гл складав 20, 60 хв і 24 години, а в розчинах ДМСО 20 хв, 1 год., 10 год., 18 год., 21 год., 24 год. і 7 діб при температурі 4°С. Для вимірювання гемолізу еритроцитів КК після додавання розчинів кріопротекторів і низькотемпературного впливу брали надосад, який отримували центрифугуванням суспензії еритроцитів протягом 5 хв. при 800g. У звязку з цим у роботі методом ДСК досліджувались умови розвитку склування, кристалізації льоду з аморфної фази, кристалізації і плавлення евтектичних складів, а також плавлення всієї системи в суспензіях еритроцитів з добавками кріопротектіров: 1,2-ПД, Гл і ДМСО різних концентрацій на етапі їх нагрівання після охолодження до-196°С. Піки кристалізації льоду з аморфної фази реєструються в зразках надосадової рідини і у зразках щільної еритроцитарної маси, отриманих після центрифугування суспензій еритроцитів з розчинами 70 мас % Гл і 60 мас % 1.2-ПД. Процес кристалізації льоду з аморфної фази реєструється в зразках еритроцитів, отриманих змішуванням суспензії еритроцитів з 70% розчином ДМСО, а при більш низьких концентраціях ДМСО процес кристалізації льоду з аморфної фази не розвивається.У дисертаційній роботі викладено теоретичне й експериментальне узагальнення наукової задачі, спрямованої на вивчення впливу 1,2-ПД, Гл і ДМСО на низькотемпературні фазові переходи і склування компонентів фетоплацентарного комплексу, а також на структурний стан еритроцитів кордової крові. Установлено закономірності розвитку кристалічних і склоподібних фаз у суспензії еритроцитів, надосадовій рідині і щільному осаді еритроцитів, а також у плазмі крові і плаценті людини в залежності від виду і концентрації проникного кріопротектора в температурному діапазоні 0 ? - 196°C. Показано, що стрибок теплоємності при переході системи з твердоаморфного стану в стан переохолодженої рідини істотно відрізняється в досліджених систем, указуючи на те, що в присутності 1,2 - ПД, Гл або ДМСО однакових концентрацій склуються різні кінетичні одиниці. У системах, що містять ДМСО, на відміну від систем з кріопротекторами з ряду поліолів спостерігається кристалізація евтектичних складів. Встановлено, що системи, які містять біологічні компоненти і кріопротектори, більш схильні до утворення аморфних фаз при охолодженні і до розвитку кристалізації води з аморфної фази при нагріванні, ніж водні розчини кріопротекторів відповідних концентрацій.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У дисертаційній роботі викладено теоретичне й експериментальне узагальнення наукової задачі, спрямованої на вивчення впливу 1,2-ПД, Гл і ДМСО на низькотемпературні фазові переходи і склування компонентів фетоплацентарного комплексу, а також на структурний стан еритроцитів кордової крові.

1. Установлено закономірності розвитку кристалічних і склоподібних фаз у суспензії еритроцитів, надосадовій рідині і щільному осаді еритроцитів, а також у плазмі крові і плаценті людини в залежності від виду і концентрації проникного кріопротектора в температурному діапазоні 0 ? - 196°C.

2. Показано, що стрибок теплоємності при переході системи з твердоаморфного стану в стан переохолодженої рідини істотно відрізняється в досліджених систем, указуючи на те, що в присутності 1,2 - ПД, Гл або ДМСО однакових концентрацій склуються різні кінетичні одиниці. Серед досліджених кріозахисних речовин стабільність аморфного стану найвища в присутності 1,2-ПД. Встановлено, що в умовах використання низькомолекулярних кріопротекторів, що мають коефіцієнт розподілу між внутрішньо- і позаклітинним середовищем близький до одиниці, висока щільність клітин сприяє склуванню внутрішньоклітинної рідини.

3. У системах, що містять ДМСО, на відміну від систем з кріопротекторами з ряду поліолів спостерігається кристалізація евтектичних складів. Це явище, поряд із кристалізацією льоду з аморфної фази нижче 0°C, являє собою додатковий фактор кріопошкодження.

4. Виявлено, що біологічні компоненти пригнічують розвиток процесів кристалізації і плавлення евтектичних складів у присутності ДМСО. При збільшенні кількості клітин у суспензії еритроцитів спостерігається посилення цієї пригнічуючої дії. Встановлено, що системи, які містять біологічні компоненти і кріопротектори, більш схильні до утворення аморфних фаз при охолодженні і до розвитку кристалізації води з аморфної фази при нагріванні, ніж водні розчини кріопротекторів відповідних концентрацій.

5. Вперше методами ДСК і ЯМР досліджена динаміка насичення плаценти кріозахисними речовинами - Гл, 1,2-ПД і ДМСО. Показано, що процес насичення тканини кріопротектором має двохфазний характер, зумовлений неодночасним насиченням поза- і внутрішньоклітинного простору. Показано, у фрагментах плаценти, охолоджених до-196°С після їх еквілібрації протягом 60 хв у розчинах, що містять 60 мас. % Гл або 1,2-ПД, не розвиваються процеси кристалізації з аморфної фази при нагріванні. Це свідчить про те, що концентрація зазначених кріопротекторів у плаценті не досягає 40мас. %. Більш тривала еквілібрація сприяє затвердінню зразка в склоподібному стані при охолодженні і формуванню дрібнодисперсного льоду при нагріванні. Експериментально виявлено, що після 18 годин еквілібрації плаценти в розчинах ДМСО 40 і 60 мас. % спостерігається зменшення вмісту ДМСО в плаценті.

6. При заморожуванні еритроцитів з середньою швидкістю 200 ЄС/хв у присутності Гл і 1,2-ПД максимальне збереження спостерігається в діапазоні концентрацій 20 ч 30 мас %, а з ДМСО - 10 ч 20 мас %. Наявність оптимальних концентрацій кріопротекторів пояснюється тим, що, з одного боку, зростання концентрації кріопротектора призводить до збільшення кількості склоподібної фази, знижуючи тим самим дію пошкоджуючих ефектів, звязаних з льодоутворенням, однак, з іншого боку, підвищує токсичність кріопротекторів.

7. Показано, що зростання концентрації Гл і 1,2-ПД викликає набрякання еритроцитів. У присутності 30ч40 мас % Гл спостерігається утворення стоматоцитарних форм, у присутності 1,2-ПД в тих же концентраціях - кренованих форм клітин. ДМСО у всьому дослідженому діапазоні концентрацій призводить до кренованості клітин. При досягненні концентрації ДМСО 30 мас % морфологічним змінам піддаються всі клітини в суспензії. Встановлено оптимальні температури еквілібрації еритроцитів КК у розчинах кріопротекторів, що складають для Гл - 20°С, для 1,2-ПД і ДМСО - 0°С.

8. Виявлено збільшення проникності мембран еритроцитів кордової крові для іонів феріціаниду в присутності кріопротекторів високих концентрацій (Гл , 1,2 - ПД - більше 40 мас % і ДМСО - більше 30 мас %), що повязано з порушенням барєрної функції мембран еритроцитів. Виявлено пошкоджуючу дію низькотемпературних фазових переходів розчинника на барєрні функції мембран еритроцитів. Зменшення мікровязкості цитоплазми після заморожування еритроцитів у присутності Гл може свідчити про набрякання клітин, що підтверджується дослідженнями методом РЕМ.

1. Зинченко А.В., Боброва Е.Н., Щетинский М.И. Влияние ДМСО на фазовые переходы и стеклование в суспензии эритроцитов кордовой крови ниже 0°С // Проблемы криобиологии. - 2003. - № 2. - С. 16-21.

2. Зинченко А.В., Боброва Е.Н., Щетинский М.И. Влияние глицерина и 1.2-пропандиола на фазовые переходы и стеклование в суспензии эритроцитов кордовой крови при температуре ниже 0°С // Доповіді НАН України. - 2003. - №12. - С. 155-160.

3. Зинченко А.В., Боброва Е.Н. Фазовые переходы и стеклование в экстрактах плаценты с добавками криопротекторов при температуре ниже 0°С // Актуальные проблемы медицины и биологии. Сб. науч. работ. Киев: КНМУ, 2004. - №1 - С. 93-97.

4. Боброва А.В., Зинченко А.В., Коваленко Г.В. Криомикроскопические исследования замораживания-оттаивания суспензий эритроцитов кордовой крови в присутствии глицерина, 1,2-пропандиола и диметилсульфоксида // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”. - 2004. -Вип. №32, част. 1. - С. 7-12.

5. Боброва Е.Н., Зинченко А.В., Щетинский М.И. Динамика насыщения ткани плаценты диметилсульфоксидом // Проблемы криобиологии. - 2005. - № 1. - С. 20-26.

6. Боброва Е.Н., Зинченко А.В., Щетинский М.И. Исследование насыщения ткани плаценты глицерином и 1,2-пропандіолом // Проблемы криобиологии. - 2005. - № 2. - С. 147-152.

7. Боброва Е.Н, Зинченко А.В. О кристаллизации воды из аморфной фазы в суспензиях эритроцитов кордовой крови при охлаждении и нагреве с 1.2-пропандиолом и глицерином // Проблемы криобиологии. -2002. - № 1. - С. 122-123.

8. Зінченко О.В., Боброва О.М., Смирнов Я.В. Кристалізація і склування в суспензії еритроцитів кордової крові в присутності гліцерину та 1.2-пропандіолу в діапазоні температур 0 ч -196°С // Тези доп. 3 зїзду Укр. біофізичного товариства, м. Львів, Україна, 8-11 жовт. 2002. - С. 224.

9. Zinchenko A.V., Bobrova E.N. Low-temperature phase transition and glass transition in cord blood erythrocytes suspensions in dependence on 1,2-propanediol and glycerol concentration // Proc. Internat. Conf. Cryobiomol 2003. Low temperature biology, Coimbra - Portugal. 14-18 sept. 2003. - P. 160.

10. Боброва Е.Н., Зинченко А. В. Физические состояния суспензий эритроцитов кордовой крови в присутствии ДМСО ниже 0°C // Тези доп. І Укр. наук. конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики”, м. Харків, Україна, 20-22 вересня 2004 р. - С. 167.

11. Боброва Е.Н., Цымбал Л.В., Зинченко А.В. Влияние низких температур и неэлектролитов на проницаемость мембран эритроцитов для парамагнитных ионов // Материалы V Харьковской конференции молодых ученых “Радиофизика и СВЧ электроника”, г. Харьков, Украина, 14 - 16 дек. 2005. - С.46.

12. Боброва О.М., Рєпін М.В., Зінченко О.В Морфофункціональні параметри еритроцитів кордової крові при додаванні кріопротекторів // Збірник тез Другої міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”, м. Львів, Україна, 21-24 бер. 2006. - С.4.

13. Боброва Е.Н., Репин Н.В., Зинченко А.В. Влияние проникающих криопротекторов на морфологическое состояние эритроцитов кордовой крови // Материалы Второй всеукр. научн.-техн. конференции “Актуальные вопросы теоретич. и прикладной физики и биофизики”, г. Севастополь, Украина, 17-22 апр. 2006. С. 85-87.

14. Боброва О.М., Репін Н.В., Зінченко О.В. Морфофункціональні параметри еритроцитів кордової крові при додаванні кріопротекторів // Збірник тез Другої міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”, м. Львів, Україна, 21-24 бер. 2006. С.4.