Вплив кріоконсервованих фібробластів на репаративні процеси при асептичному запаленні шкіри в експерименті - Автореферат

У більшості робіт автори використовували або первинно культивовані фібробласти, або фібробласти, які культивували після кріоконсервування (В.Д. У клінічній практиці доволі часто виникає необхідність гіпотермічного зберігання фібробластів перед застосуванням, а в технологіях отримання фібробластів - зберігання біоптатів шкіри перед культивуванням. Метою роботи було порівняльне дослідження впливу кріоконсервованих та нативних фібробластів на репаративні процеси при асептичному запаленні шкіри у щурів та вивчення можливості отримання фібробластів з біоптатів шкіри після кріоконсервування та гіпотермічного зберігання. Провести порівняльне вивчення ефективності методів отримання фібробластів після ферментативної обробки біоптатів та культивування механічно подрібнених біоптатів. Дослідити можливість отримання фібробластів із біоптатів шкіри після зберігання в умовах гіпотермії і кріоконсервування.Біоптати шкіри розташовували у флаконах з розчином Хенкса, сироваткою крові щурів та середовищем 199 з 10% сироватки крові щурів і зберігали при 4?С. Збереженість фібробластів, які інкубували протягом доби з МЦ гелем та протягом 3 діб на губці «Геласпон», визначали по здатності клітин формувати моношар при подальшому культивуванні у ростовому середовищі. Щурів розподіляли на 8 груп по 26 тварин у кожній: 1-процес загоєння дефекту протікав природним шляхом (контроль); 2 - нанесення на дефект МЦ гелю; 3 - нанесення нативних фібробластів в МЦ гелі; 4 - нанесення кріоконсервованих фібробластів в МЦ гелі; 5 - нанесення безклітинної маси зруйнованих фібробластів в МЦ гелі; 6 - нанесення колагенової губки «Геласпон»; 7 - нанесення нативних фібробластів на колагеновій губці «Геласпон»; 8 - нанесення кріоконсервованих фібробластів на колагеновій губці «Геласпон». Біоптати після зберігання у сироватці крові щурів протягом 7 діб давали вихід фібробластів на 7-9 добу наступного культивування, а протягом 14 діб - на 16-18 добу. При гіпотермічному зберіганні шкірних біоптатів у розчині Хенкса протягом 7 діб виселення фібробластів починалося на 9-10 добу, а протягом 14 діб - на 14-15 добу.В роботі проведені експериментальні дослідження, в яких була показана терапевтична ефективність кріоконсервованих алогенних фібробластів без додаткового культивування на моделі асептичного запалення шкіри у щурів. Нативні та кріоконсервовані фібробласти, які наносили на шкірний дефект при експериментальному асептичному запаленні шкіри у щурів, виявляли вірогідну стимулюючу дію на репаративні процеси. Процеси регенерації у шкірних дефектах були більш виражені при нанесенні на ранову поверхню препаратів кріоконсервованих та нативних фібробластів, іммобілізованих у МЦ гелі, у порівнянні з препаратами фібробластів, іммобілізованими на колагеновій губці «Геласпон». Вихід фібробластів з біоптатів шкіри щурів, які зберігали при температурі 4°С, у сироватці крові щурів, а також подальше формування моношару спостерігали пізніше, ніж при культивуванні біоптатів, які не піддавали зберіганню. Фібробласти, отримані з біоптатів шкіри щурів, зберігали життєздатність при гіпотермічному зберіганні у розчині Хенкса та у середовищі 199 протягом 48 годин.

Основний зміст роботи

Актуальною задачею медицини є обгрунтування можливості використання кріоконсервованих фібробластів для стимуляції репаративних процесів у ранових поверхнях з метою скорочення строків їх загоєння та зменшення ризику утворення косметичних дефектів або виразок. В роботі проведені експериментальні дослідження, в яких була показана терапевтична ефективність кріоконсервованих алогенних фібробластів без додаткового культивування на моделі асептичного запалення шкіри у щурів. Була встановлена відсутність достовірної різниці у стимулюючій дії нативних та кріоконсервованих фібробластів на процеси загоєння шкірних дефектів.

1. Нативні та кріоконсервовані фібробласти, які наносили на шкірний дефект при експериментальному асептичному запаленні шкіри у щурів, виявляли вірогідну стимулюючу дію на репаративні процеси. Ця дія проявлялася у більш швидкому загоєнні ран, зменшенні фібриноїдно-некротичного шару в дефектах шкіри, швидкості формування грануляційної тканини та інтенсивності росту епітелію на поверхні дефекту. Різниці між стимулюючою дією на репаративні процеси нативних і кріоконсервованих фібробластів відсутні.

2. Метилцелюлозний гель виявляє помірно виражений терапевтичний ефект при нанесенні на ранову поверхню. Процеси регенерації у шкірних дефектах були більш виражені при нанесенні на ранову поверхню препаратів кріоконсервованих та нативних фібробластів, іммобілізованих у МЦ гелі, у порівнянні з препаратами фібробластів, іммобілізованими на колагеновій губці «Геласпон».

3. Зростання концентрації позитивних реактантів гострої фази запалення при утворенні шкірних дефектів та їх подальше відновлення до норми корелюють з динамікою процесів регенерації в ушкоджених тканинах у всіх експериментальних групах щурів. Відновлення вмісту цих білків найбільш виражено при нанесенні на рани препаратів нативних та кріоконсервованих фібробластів.

4. Отримання фібробластів шляхом культивування механічно подрібнених біоптатів шкіри щурів більш ефективне, ніж отримання фібробластів методом ферментативної обробки.

5. Отримання фібробластів з біоптатів шкіри щурів можливе після їх гіпотермічного зберігання протягом 14 діб у сироватці крові щурів. Вихід фібробластів з біоптатів шкіри щурів, які зберігали при температурі 4°С, у сироватці крові щурів, а також подальше формування моношару спостерігали пізніше, ніж при культивуванні біоптатів, які не піддавали зберіганню. На відміну від гіпотермічного зберігання, вихід фібробластів з кріоконсервованих біоптатів шкіри щурів не відбувався.

6. Фібробласти, отримані з біоптатів шкіри щурів, зберігали життєздатність при гіпотермічному зберіганні у розчині Хенкса та у середовищі 199 протягом 48 годин. Після зберігання протягом 72 годин у вище згаданих середовищах фібробласти гинули. Кріоконсервування фібробластів у ембріональній сироватці ВРХ та в ембріональній сироватці ВРХ з 10 % ДМСО забезпечувало високу збереженість фібробластів.

Перелік опублікованих робіт

1. Абрафикова Л.Г. Влияние условий криоконсервирования на сохранность кожи и фибробластов человека / Абрафикова Л.Г, Петренко Т.Ф., Высеканцев И.П // «Проблемы криобиологии» - Харьков.- 2008. - Т. 18, №3, С. 275 - 278.

2. Абрафикова Л.Г. Гипотермическое хранение и криоконсервирование в технологии получения фибробластов из кожи человека / Абрафикова Л.Г, Высеканцев И.П., Петренко Т.Ф. // Проблемы криобиологии.- Харьков.-2008.- №1.-Т.18.- С. 91-95.

3. Абрафикова Л.Г/ Роль аллофибробластов в процессах регенерации ран / Абрафикова Л.Г, Петренко Т.Ф., Кощий С.В., Гончарук Е.И. // Журнал «Актуальні проблеми сучасної медицини: Вестник Украинской медицинской стоматологической академии», Полтава. - Т. 9.- выпуск 4 (28).- 2009 - часть 3 - С. 11-15.

4. Абрафикова Л.Г. Влияние нативних и криоконсервированных аллофибробластов на процессы регенерации кожных язв у крыс / Абрафикова Л.Г, Петренко Т.Ф., Высеканцев И.П., Грищенко В.И. // «Запорожский медицинский журнал».- Запорожье. - Т. 12.- 2010.- С. 5-8.

5. Абрафикова Л.Г. Морфологическая оценка процесса заживления экспериментальных кожных язв у крыс после внесения криоконсервированных фибробластов / Абрафикова Л.Г.// «Патология». - Запорожье. - Т.7.- №3.- 2010.-С. 113-115.

6. Пат. 92678 UA Україна, МПК А01N 1/02, С 12N 1/01, С 12N 5/02. Спосіб підвищення резистентності клітин до заморожування-відігріву / Висеканцев І.П., Нардід О.А., Кудокоцева О.В., Кощій С.В., Розанова С.Л., Абрафікова Л.Г.; заявник і патентовласник ІПКІК НАН України.- заявл. 05.05.2010; опубл. 25.11.2010, Бюл. № 22.

7. Абрафікова Л.Г. Одержання постнатальних фібробластів людини з використанням кріогенних технологій / Абрафікова Л.Г., Висеканцев І.П., Петренко Т.П., Гончарук О.І. // Збірник тез 1 Міжнародної конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ в біології».- Львів, 2005, С. 218.

8. Абрафикова Л.Г. Сравнительное изучение сохранности фибробластов человека криоконсервированных под защитой и без криопротектора / Абрафикова Л.Г. // Сборник тезисов конференции «Сохранение генетических ресурсов» - Москва. 2006.- С.229-230.

9. Абрафикова Л.Г. Вивчення проліферативних властивостей фібробластів людини після кріоконсервування без кріопротектора / Абрафикова Л.Г // Збірник тез конференції молодих вчених «Медична наука: сучасні досягнення та інновації»- Харків.- 2006.- С.3

10. Абрафикова Л.Г. Вплив температурних режимів зберігання на життєздатність кріоконсервованих фібробластів / Абрафикова Л.Г // Збірник тез 2 міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ в біології»- Львів.-2006.- С.332

11. Абрафикова Л.Г. Кріоконсервування, як етап одержання та практичного використання фібробластів / Абрафикова Л.Г // Збірник тез 3 Міжнародної медико - фармацевтичної конференції студентів і молодих вчених. «Хист»-Чернівці.- 2006.- С.9

12. Абрафикова Л.Г. Кріоконсервування аутофібробластів у середовищах без кріопротектора /Абрафикова Л.Г // «Український науково - медичний молодіжний журнал»- Київ.- 2006.- С. 49

13. Abrafikova L.G. Biological activity of frozen- thawed autofibroblasts / ABRAFIKOVAL.G.// Сборник тезисов конференции «Modern problems of Microbiology and Biotehnology». Одесса - 2007.- Р.119

14. Абрафикова Л.Г. Продукция цитокинов мононуклеарными клетками при культивировании с аллогенными фибробластами «in vitro» / Абрафикова Л.Г., Власов А.А.// Сборник тезисов конференции «Актуальні питання сучасної медицини».- Харьков. - 2008. - С. 13

15. Абрафикова Л.Г. Изучение влияния гипотермии на пролиферацию фиброластов из кожных биоптатов лабораторных животных / Абрафикова Л.Г // Всеукраїнський медичний журнал молодих вчених «Хист».- Чернівці.- 2008.- вип.10. - С. 193

16. Абрафикова Л.Г. Криоконсервирование и гипотермическое хранение кожных биоптатов и аутофибробластов человека / Абрафикова Л.Г, Высеканцев И.П., Петренко Т.Ф., Гончарук Е.И. // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клітин».- Самара.- 2008.- С. 134.

17. Абрафикова Л.Г. Влияние экстракта плаценты человека и криопротекторов на сохранность мембраны фибробластов человека / Абрафикова Л.Г, Розанова Е.Д., Высеканцев И.П., Нардид О.А// Проблемы криобиологии.- Харьков.- Т.18.- №2.- 2008.-С. 228.

18. Possible application of native and cryopreserved allofibroblasts for recovery of integral skin integument in experimental animals / ABRAFIKOVAL.G., Petrenko T., Batsunova L.// Український біохімічний журнал.- Ялта.- Т. 81. - №4 - 2009 - С.283

19. Абрафикова Л.Г Влияние нативних, криоконсервированных и разрушенных фибробластов на процесс заживления експериментальных ран у крыс / Абрафикова Л.Г, Шевчук С.Н., Буденный А.П.// Сборник тезисов конференции «Актуальні питання сучасної медицини».- Харьков.- 2010.- С. 13-14