Вплив кріоконсервованих ембріональних соматичних клітин на стан шкіри та хряща щурів після травматичного ушкодження - Автореферат

При такому поєднанні біологічних особливостей можна припустити високу ранозагоюючу ефективність застосування СЕК при травматичних ушкодженнях сполучної тканини, зокрема шкіри та хряща, що зумовлює доцільність дослідження впливу цих клітин на перебіг репаративних процесів у модельних системах. Однак метод кріоконсервування первинної суспензії СЕК, який би дозволив зберегти максимальну кількість клітинних елементів у повноцінному стані, до теперішнього часу не розроблений, а дослідження, спрямовані на порівняння дії свіжоізольованих і кріоконсервованих СЕК при травматичному ушкодженні тканин, залишаються актуальними. Робота виконана у відділі кріобіохімії в рамках планової теми НДР ІПКІК НАН України №7 “Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їх кріочутливості і механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних станів”, № ДР 0102U002026, і теми № 9 “Вивчення клоногенного потенціалу і здатності до мультилінійної диференціації фібробластоподібних стромальних клітин ембріонів людини”, яка виконувалася згідно з планом НДР МНЦ ІПКІК НАН, АМН та МОЗ України. Метою дисертаційної роботи було визначити умови отримання та кріоконсервування первинних суспензій СЕК щурів, а також оцінити їхній вплив на протікання репаративних процесів при експериментальному термічному ураженні шкіри і механічному ушкодженні суглобового хряща. Для вирішення поставлених задач були використані кріобіологічні, клініко-лабораторні, морфологічні, біохімічні і статистичні методи: програмне трьохетапне заморожування під захистом кріопротекторів; визначення кількості і збереженості клітин у суспензії; культивування клітин in vitro; моделювання травми сполучної тканини шкіри і суглобового хряща; планіметричне визначення площі ушкодженої шкіри; визначення лабораторних показників периферичної крові; гістологічна і гістохімічна оцінка стану шкіри і хрящової тканини; біохімічне визначення кількості специфічних білків і глікозаміногліканів (ГАГ) у дермі експериментальних тварин.Експерименти були проведені на 180 безпородних білих щурах відповідно до „Загальних принципів експериментів на тваринах”, схвалених I Національним конгресом з біоетики (20.09.04 р., Київ, Україна) і узгоджених з положеннями “Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей” (Страсбург, 1985). Вплив суспензії СЕК на відновні процеси в ранах суглобового хряща і шкіри оцінювали на моделях травматичного ушкодження колінного суглоба (Зупанец И.А. с соавт., 1989) і термічного ушкодження шкіри (Хакимов З.З., 1985) статевозрілих щурів. Для отримання оглядових препаратів зрізи товщиною 5-7 мкм фарбували гематоксиліном та еозином та за методом Ван Гізон (Меркулов Г.А., 1961), глікозаміноглікани (ГАГ) виявляли за допомогою ШИК-реакціі за методом Мак Мануса-Хочкіса, та за комбінованим методом Моурі з альціановим синім (Пирс Э., 1962; Mowry R.W., 1963, Лилли Р., 1969) для визначення активності дезоксинуклеопротеїдів (ДНП) та рибонуклеопротеїдів (РНП) використовували офарблення за Фельгеном-Россенбеком і реакцію Браше (Волкова О.В., 1971). СЕК, які були отримані при механічній дезінтеграції з використанням попередньої ферментативної обробки тканин в умовах гіпотермії, при короткостроковому культивуванні активно адгезували до субстрату, розпластувалися і в подальшому формували моношар. Порівняльне вивчення дії свіжоізольованих, кріоконсервованих і кріопошкоджених СЕК на перебіг репаративних процесів при травматичному ушкодженні хрящової тканини показало, що через 21-шу добу після травми хряща колінного суглоба у тварин груп 1 (контроль) і 2, (в рану вводили носій - колагенову губку без клітин), відновлювання цілісності суглобового хряща не відбувалось.В дисертаційній роботі представлено теоретичне та експериментальне узагальнення наукової проблеми, яка стосується вдосконалення методів кріоконсервування соматичних ембріональних клітин шляхом визначення умов виділення клітин і складу адекватних кріоконсервуючих середовищ, а також доцільності використання кріоконсервованої первинної суспензії СЕК для стимуляції репаративних процесів в ушкодженій сполучній тканині шкіри та суглобового хряща. Визначені умови виділення СЕК щурів: показано, що поєднання попередньої ферментативної обробки тканин протягом 20 годин в умовах гіпотермії з наступною механічною дезінтеграцією є оптимальним для отримання первинної суспензії життєздатних клітин, які спроможні прикріплюватись до субстрату, розпластуватись та формувати моношар в умовах культивування in vitro. Порівняння кріозахисної дії ДМСО, ембріональної сироватки, ПЕО-1500 та їх комбінацій при кріоконсервуванні СЕК за трьохетапною програмою заморожування виявило перевагу середовища заморожування, яке містить 10% ДМСО та 10% ембріональної сироватки - деконсервована суспензія мала збереженість клітин не нижче 60%, які були здатні при подальшому культивуванні до формування осередків росту. Введення суспенз

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ