Вплив алкалоїдів і тритерпенів чистотілу (Chelidonium majus L.) на проліферативну активність та метаболічні показники клітин in vitro - Автореферат

Чистотіл (Chelidonium majus L.) широко застосовують у народній (традиційній) і офіційній медицині для лікування багатьох хвороб, зокрема для лікування пухлин. Екстракти з чистотілу володіють антибактеріальною, противірусною та протигрибковою дією. Тому першочерговим завданням нашої роботи було розробити оптимальні методи отримання чотирьох основних алкалоїдів чистотілу, таких як хелідонін, сангвінарин, хелеритрин та коптизин. Вивчити вплив індивідуальних алкалоїдів чистотілу на фізико-хімічні властивості ДНК; алкалоїд чистотіл тритерпен пухлинний Дослідити вплив алкалоїдів чистотілу на утилізацію глюкози та продукування молочної кислоти пухлинними клітинами;У дисертації, відповідно до поставленої мети та задач, було розроблено методики отримання чотирьох основних алкалоїдів чистотілу: хелідоніну, сангвінарину, хелеритрину та коптизину. Проведено порівняльне дослідження впливу індивідуальних алкалоїдів чистотілу (сангвінарин, хелідонін, хелеритрин, коптизин, берберин) на проліферацію пухлинних клітин і утилізацію ними глюкози in vitro. Досліджено цитотоксичну дію отриманих речовин щодо лейкемічних клітини лінії L1210, вплив на утилізацію глюкози та утворення молочної кислоти клітинами NK/Ly лейкемії миші, а також вплив на функціональну активність нейтрофільних гранулоцитів крові людини. Отримано в чистому стані 5 основних алкалоїдів чистотілу: хелідонін, сангвінарин, хелеритрин, коптизин та берберин; досліджено їх фізико-хімічні властивості і біологічну активність в культурі клітин. Найбільш виражену цитотоксичну дію в культурі лейкемічних клітин L1210 проявляють сангвінарин і хелеритрин, концентрація півмаксимального ефекту пригнічення проліферації становить відповідно 2,5 мкг/мл та 1,0 мкг/мл.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У дисертації, відповідно до поставленої мети та задач, було розроблено методики отримання чотирьох основних алкалоїдів чистотілу: хелідоніну, сангвінарину, хелеритрину та коптизину. Проведено порівняльне дослідження впливу індивідуальних алкалоїдів чистотілу (сангвінарин, хелідонін, хелеритрин, коптизин, берберин) на проліферацію пухлинних клітин і утилізацію ними глюкози in vitro. Досліджено цитотоксичну дію отриманих речовин щодо лейкемічних клітини лінії L1210, вплив на утилізацію глюкози та утворення молочної кислоти клітинами NK/Ly лейкемії миші, а також вплив на функціональну активність нейтрофільних гранулоцитів крові людини. Виявлено кореляцію між цитотоксичною активністю алкалоїдів і їх здатністю інтеркалювати в молекулу ДНК. Отримано препарат тритерпенового сапоніну чистотілу, досліджено його фізико-хімічні властивості і біологічну активність in vitro.

Розроблено методики фракціонування алкалоїдів чистотілу і очистки основних алкалоїдів шляхом поступової екстракції в різних умовах без застосування хроматографічних методів очистки. Отримано в чистому стані 5 основних алкалоїдів чистотілу: хелідонін, сангвінарин, хелеритрин, коптизин та берберин; досліджено їх фізико-хімічні властивості і біологічну активність в культурі клітин.

Найбільш виражену цитотоксичну дію в культурі лейкемічних клітин L1210 проявляють сангвінарин і хелеритрин, концентрація півмаксимального ефекту пригнічення проліферації становить відповідно 2,5 мкг/мл та 1,0 мкг/мл. Коптизин та берберин є значно слабшими цитотоксичними агентами, концентрація півмаксимального ефекту пригнічення проліферації становить 10 мкг/мл для кожної з цих речовин. Хелідонін не викликає загибелі клітин, однак блокує їх проліферацію (цитостатична дія). Під впливом досліджуваних алкалоїдів клітини гинуть шляхом апоптозу, що проявляється фрагментацією ДНК та утворенням апоптичних тілець.

У досліджених алкалоїдів чистотілу спорідненість до ДНК і ефективність інтеркаляції зменшується у порядку: сангвінарин, хелеритрин, коптизин, берберин. Відомий інтеркалятор актиноміцин D за активністю відповідає берберину. Хелідонін не взаємодіє з ДНК і не впливає на стабільність її конформації.

При дослідженні впливу основних алкалоїдів чистотілу на функціональну активність нейтрофільних гранулоцитів людини встановлено, що найбільш активними інгібіторами гранулоцитів є сангвінарин та хелеритрин, які пригнічують хемілюмінесценцію і фагоцитоз в концентраціях 1-4 мкг/мл. Особливий вплив на функціональну активність нейтрофільних гранулоцитів виявлено у хелідоніну, який пригнічує хемілюмінесценцію (на 30-40 % менше відносно контролю), проте стимулює фагоцитарну активність нейтрофільних гранулоцитів (на 15-40 % більше відносно контролю).

Сангвінарин, хелеритрин, коптизин та берберин підвищують швидкість утилізації глюкози та продукування молочної кислоти клітинами мишачої лімфоми NK/Ly. Вплив сангвінарину та хелеритрину виявляється у концентрації 1-2 мкг/мл, коптизин та берберин виявляють подібну дію у концентрації 10 мкг/мл. Хелідонін не викликав достовірних змін у порівнянні з контролем.

Препарат сапоніну, отриманий із насіння чистотілу, проявляв цитотоксичну активність у концентраціях вище 40 мг/мл. У нетоксичних концентраціях він стимулює фагоцитарну активність нейтрофільних гранулоцитів людини.

Отримані результати свідчать, що індивідуальні алкалоїди чистотілу проявляють різноспрямовані, часто протилежні біологічні ефекти, у звязку з чим доцільним є розділення складних природних сумішей і дослідження біологічної активності окремих компонентів.

1. Вплив алкалоїдів чистотілу (Chelidonium majus L.) на функціональну активність гранулоцитів крові людини / М. Луцик-Кордовский, Т. Гулик, Ю. Осип, Р. Стойка // Вісник Львів. університету. Серія біологічна. - 2004. - 35. - С. 47-53. (Дисертанту належить підготовка зразків для дослідів, робота по отриманню біологічно-активних речовин, визначення впливу досліджуваних речовин на фагоцитарну активність нейтрофільних гранулоцитів крові, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

2. Вплив складу розчинника та інтеркалюючих лігандів на конформаційну стабільність молекули ДНК / Ю.Л. Осип, В.О. Камінський, М.Д. Луцик, Р.С. Стойка // Медична хімія - 2004. - Т. 6, № 3 - С. 30-33. (Дисертанту належить робота по отриманню біологічно-активних речовин та проведення експериментів стосовно визначення впливу алкалоїдів чистотілу на температуру термоденатурації ДНК, участь в аналізі результатів).

3. Використання стимульованих мітогеном лімфоцитів як клітин-мішеней при тестуванні речовин на антипроліферативну активність / М.Д. Луцик, Лін Ках Вай, Ю.Л. Осип, Р.С. Стойка // Експериментальна та клінічна фізіологія та біохімія. - 2005. - № 1. - С. 19-24. (Дисертанту належить робота по отриманню біологічно-активних речовин, участь у експериментах, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

4. Осип Ю.Л., Гулик Т.М. Вплив алкалоїдів чистотілу (Chelidonium majus L.) на функціональну активність гранулоцитів крові // VI-та конференція молодих онкологів України - Київ. - 4-5 грудня, 2003. - С. 46. (Дисертанту належить робота по отриманню біологічно-активних речовин та визначення їх впливу на фагоцитарну активність нейтрофільних гранулоцитів крові, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

5. Lutsik M.D., Osyp Yu.L., Stoika R.S. Comparative study of alkaloid/DNA interactions using individual alkaloids from greater celandine (Chelidonium majus L.) // Ionic Soft Matter: Novel trends in theory and applications - Lviv, Ukraine - April 14-17, 2004. - P. 14. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

6. Osyp Yu.L., Lutsik M.D., Stoika R.S. Physicochemical characteristics of DNA-alkaloid interactions // Abstr. First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv. - April 25-28, 2004. - P. 362. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних).

7. Antiproliferative and immunomodulating effect of individual alkaloids isolated from roots of Chelidonium majus L / M.D. Lutsik, Yu.L. Osyp, M.L. Barska, M.A. Starykovych, R.S. Stoika // Abstr. First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv. - April 25-28, 2004. - P. 254. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних).

8. Осип Ю.Л. Вплив основних алкалоїдів чистотілу (Chelidonium majus L.) на фізико-хімічні властивості ДНК // Звітна конференція молодих вчених інституту біології клітини - Львів. - 16 червня, 2005. - С. 19. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).