Внутрішньоклітинний метаболізм мікробних популяцій травного тракту тварин за дії екзогенних факторів - Автореферат

У жуйних тварин такі мікробні популяції містяться, головним чином, у передшлунках, а у свиней, кролів та інших тварин - переважно у товстій кишці, куди надходять всі неперетравні поживні частки рослин низької розчинності й ензимної недоступності (проламіни й глютаміни, клітковина тощо), а також протеїди ендогенного походження (ензими, секрети муцину, клітинні десквамати тощо). Доведено, що однією з найпоширеніших токсичних сполук у довкіллі є пентахлорофенол (ПХФ), у звязку з чим пріоритетним вважається вивчення особливостей його дії на всі ланки екобіосистеми, в тому числі й на стан здоровя людини та тварин, а також на пошук ефективних способів його деградації за допомогою мікробів тощо (Keit L.H., Talliard W.A., 1979; Sato K., 1985; Valo R. et al., 1985; Yokoyama М.Т. et al., 1988; Kmet’ V., Baran M., Kalachnyuk G.I., 1990; Калачнюк Л.Г. та ін., 2002-2006). Потрапляння ПХФ у ШКТ може супроводжуватися зниженням резистентності мікробної популяції і цілого макроорганізму-господаря, а також значними втратами продуктивності тварин та низькою якістю одержаної продукції. Ґжицького, які виконувалися на замовлення Департаменту кадрової політики, аграрної освіти та науки Мінагрополітики України з тем 9/1 і 9/9 (№ держреєстрації 0198U008022) “Розробити нові, комплексні біотехнологічні способи підвищення вмісту рістстимулюючих речовин у природних кормових засобах”, а також фрагментом науково-дослідних робіт, проведених спільно з Інститутом фізіології і генетики тварин Чеської Академії наук, з тем: 1) “Розробка фізіолого-біохімічних і біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин”; 2) “Біотехнологічні аспекти регуляції процесів травлення у тварин”; 3) “Вивчення метаболічних процесів в організмі тварин”, у яких автором вивчалися біохімічні процеси в клітинах мікробних популяцій травного тракту тварин за дії екзо-й ендогенних чинників. Мета роботи - зясувати особливості й роль інтрацелюлярного метаболізму змішаних мікробних популяцій та чистих штамів бактерій шлунково-кишкового тракту у різних видів тварин за умов дії окремих антимікробних сполук (ПХФ) і речовин із протекторними властивостями (Кл) на тлі зміни використання різних за доступністю й поживною цінністю біосубстратів.Молярне співвідношення коротколанцюгових карбонових кислот (С2, С3, С4) змінюється із 59,1:31,2:9,7 на 50,4:40,9:8,7, вказуючи на те що за допомогою субстратної корекції рубцевого мікробного метаболізму можна досягнути значних кількісно-якісних зрушень у процесах формування фонду кінцевих продуктів ферментації, які далі суттєво впливають на інтермедіарний метаболізм тварини-господаря і його продуктувність. Подібна картина спостерігається і при вивченні токсичної дії ПХФ на другу мікробну популяцію, яка була сформована на доступніших біосубстратах, тобто за умов споживання тваринами у 2 рази більше зерноконцентратів та майже вдвічі менше клітковини (рис. За умов формування першої популяції на менш доступних біосубстратах дуже чутливими до дії біоциду виявилися бактерії, які продукують пропіонат. Разом із тим, порівняно нижчий рівень продукції лактату при ферментації менш доступних поживних речовин (клітковини) і висока чутливість целюлозолітичних бактерій до дії низьких доз ПХФ значно знижують функціональну активність змішаної мікробної популяції. Тут є вірогідно (р <0,01) вищою целюлозолітична активність, що вказує на кращу пристосованість цієї мікробної популяції до утилізації клітковини, і саме дана (перша) популяція виявилась більш чутливою до ПХФ, ніж друга, що видно з чітко вираженого зниження (р.<.0,001) метаболічних процесів, які віддзеркалюються кривими змін рівнів росту мікробів, РН, ЛЖК і N·NH3, лактату та активності ензимів (целюлази й амілази).У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення та отримано нові дані стосовно внутрішньоклітинного метаболізму мікробних популяцій шлунково-кишкового тракту тварин, а також показано особливості інгібуючої дії пентахлорофенолу та можливості підвищення ефективності використання протекторних властивостей природних сорбентів - кліноптилолітів з метою нормалізації ензиматичних реакцій на рівні внутрішньоклітинного метаболізму й утворення кінцевих продуктів катаболізму як у змішаних асоціаціях мікрорганізмів-симбіонтів, так і в окремих комплексах їх різновидів та чистих штамах бактерій. Різні дози антимікробної сполуки ПХФ проявляють неоднакову інгібуючу дію на внутрішньоклітинний метаболізм змішаних рубцевих мікробних популяцій, сформованих на різних за поживною доступністю біосубстратах. Навіть низькі дози токсиканта (10-40 МКМ) інгібують на 80-90.% внутрішньоклітинний метаболізм мікробних популяцій, сформованих на менш доступних джерелах поживних речовин, а середні (100-150 МКМ) й високі (300 МКМ) - зовсім зупиняють функціонування клітин. Внесення природних сорбентів у культуральне середовище за умов дії низьких доз ПХФ (до 40 МКМ) вірогідно (р <0,05) знижує інгібуючий вплив цієї токсичної сполуки на мікробний метаболізм порівнюваних популяцій, але кліноптилоліти проявля

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Метаболізм мікробних популяцій, сформованих на біосубстратах різної доступності. Формування й ефективність мікробних популяцій передусім залежать від поживності й доступності кормових засобів у дієті. Якщо у сухій речовині раціонів переважає вміст менш доступного біосубстрату - клітковини (за рахунок соломи й сіна), то сформована на ній рубцева мікробна популяція продукує підвищену кількість ацетату й метану при більших витратах тепла. Зростання в раціоні вмісту доступніших біосубстратів - крохмалю (переважно за рахунок зерноконцентратів) призводить до формування мікробної популяції, яка продукує підвищену кількість ЛЖК, у сумі яких вірогідно збільшується молярний відсоток пропіонату при зниженні процесів метаноутворення й тепловитрат. Адже синтез пропіонової кислоти конкурує з утворенням СН4 у процесах використання водню. Такі зміни супроводжуються підвищенням рівня амілолітичної активності, лактатогенезу й аміакоутворення при зниженні целюлозолітичної активності та РН. Молярне співвідношення коротколанцюгових карбонових кислот (С2, С3, С4) змінюється із 59,1:31,2:9,7 на 50,4:40,9:8,7, вказуючи на те що за допомогою субстратної корекції рубцевого мікробного метаболізму можна досягнути значних кількісно-якісних зрушень у процесах формування фонду кінцевих продуктів ферментації, які далі суттєво впливають на інтермедіарний метаболізм тварини-господаря і його продуктувність. Так, на рубцевій ферментації більш доступних біосубстратів у крові відгодівельних бичків приблизно на 30 % зростають концентрації глюкози й амінного нітрогену при вірогідному (р.<.0,05) зниженні (приблизно на 20?40 %) вмісту сечовини, лактату і кетонових тіл. При цьому середньодобові прирости маси тіла тварин збільшуються приблизно на 32 % (1064±46 проти 802±38 г).

Інгібуюча дія різних доз ПХФ на метаболічну здатність мікробних популяцій, сформованих на менш і більш доступних біосубстратах. Перша змішана популяція мікроорганізмів-симбіонтів рубця, що була сформована на менш доступних біосубстратах при поїданні бичками багатих на клітковину кормів із порівняно невеликим вмістом зерноконцентратів, є значно чутливішою від другої до дії навіть знижених концентрацій ПХФ (10, 20 і 40 МКМ; рис. 1).

Середні дози ПХФ (100 і 150 МКМ) тут гальмують ріст мікробів на 80?90.%, а високі (300 МКМ) - повністю зупиняють метаболізм. Це чітко підтверджується вірогідними змінами (р < 0,05) показників динаміки утворення різних кінцевих продуктів ферментації (ЛЖК, N·NH3, лактат, РН, активність ензимів целюлази й амілази, ріст мікробної біомаси тощо). Подібна картина спостерігається і при вивченні токсичної дії ПХФ на другу мікробну популяцію, яка була сформована на доступніших біосубстратах, тобто за умов споживання тваринами у 2 рази більше зерноконцентратів та майже вдвічі менше клітковини (рис. 2).

Однак слід зазначити, що другій мікробній популяції рубця притаманна нижча целюлозолітична і суттєво вища амілолітична активності. Згадані ензими тут менш чутливі до дії метаболізму більш доступних кормових засобів і загалом створюють порівняно потужніший пул необхідних біосубстратів для багатьох різновидів мікробів, що утилізують їх та здатні успішніше протистояти токсичній дії ПХФ. Тому низькі дози останнього (10?40 МКМ), очевидно, менше впливають на весь мікробний комплекс. Середні дози (100 і 150 МКМ) інгібують метаболізм лише на 40-50 % і тільки високі дози (300 МКМ) повністю паралізують функції цієї більш життєздатної мікробної популяції.

За умов формування першої популяції на менш доступних біосубстратах дуже чутливими до дії біоциду виявилися бактерії, які продукують пропіонат. В інкубаційному середовищі вже за концентрації 20 МКМ ПХФ кількість пропіонату вірогідно (р .100.МКМ). Таке явище можна пояснити високою ефективністю взаємозвязків синтрофних мікробів рубця, які стійкі до токсиканта, продукують лактат (наприклад, Streptococcus bovis) та утилізують його (наприклад, Megasphaera elsdenii). Це підтверджується зростанням утричі рівня продукції лактату, який далі здатний перетворюватися до пропіонату, бутирату, ізобутирату, валеріату, СО2 і Н2 (Bartos S., 1987). У разі утримування тварин на зерноконцентратах пропіонат у рубці може синтезуватися з пірувату і лактату акрилатним шляхом (Войтюк О.А., 1995). Використовуючи цей механізм, окремі токсиностійкі бактерії рубця, очевидно, спроможні постійно підтримувати високий фонд пропіонату та інших важливих інтермедіатів як для всієї мікробної популяції рубця, так і для цілого організму тварини-господаря. Разом із тим, порівняно нижчий рівень продукції лактату при ферментації менш доступних поживних речовин (клітковини) і висока чутливість целюлозолітичних бактерій до дії низьких доз ПХФ значно знижують функціональну активність змішаної мікробної популяції. Адже за умов збільшення вмісту клітковини в раціоні з 11 до 21 % молярний відсоток пропіонату в сумі кислот бродіння зменшується вдвічі, а втрати енергії зростають з 17 до 26 %. Вихід енергії АТР за таких умов складає лише 4,8 % енергії зброджених вуглеводів (Танцуров Г.В., 2000).

Зниження токсичної дії біоциду за допомогою Кл. У процесі інкубації рубцевих змішаних мікробних популяцій, сформованих на більш і менш доступних біосубстратах, у змінах динаміки росту мікроорганізмів, сумарної продукції коротколанцюгових карбонових кислот, амонієгенезу і лактатоутворення відмічаються спільні риси (рис. 3). Вони полягають у тому, що у 1 (контрольному) варіанті наведені показники інтенсивності мікробної ферментації перебувають на найвищому рівні (крива - 1). Такі дані відображають нормальний хід метаболічних процесів за звичайних умов інкубації. Вірогідні зміни (р < 0,05) у динаміку мікробного метаболізму вносить введення відносно низької дози (40 МКМ) ПХФ (варіант 2 і крива 2). На стартових годинах інкубації відмінності між вказаними варіантами (криві 1 і 2), залежно від вибору показника, можуть перевищувати багатократний рівень, тоді як на часовому відрізку між 8 і 12 год вони значно зменшуються. Це свідчить про особливу інгібуючу дію ПХФ на життєдіяльність змішаної мікробної популяції, передусім на початкових стадіях lag-фази розвитку й відновлення окремих її різновидів. Згодом менш чутливі до біоциду види мікробів посилюють свій ріст, але досягнути контрольного (крива 1) високого рівня метаболізму в складі змішаної популяції не можуть. Це підтверджується динамікою змін РН та рівнями активності найбільш характерних для рубцевої мікробної екосистеми ензимів, що розщеплюють целюлозу і крохмаль. Целюлозолітична активність (СА) під дією ПХФ знижується в 3 рази, а амілолітична активність ? у 2 рази. Такі зміни узгоджуються з попередніми даними і свідчать про те, що з усіх видів мікроорганізмів особливо чутливими до біоциду є целюлозолітичні мікроби.

Вірогідні зміни (р < 0,05) показників метаболізму змішаної рубцевої мікробної популяції, що перебувають під впливом ПХФ, викликає додавання Кл (крива 3). Сорбуючі, іонообмінні та інші властивості кліноптилоліту, очевидно, здатні звязувати не тільки надлишки вже відомих нам токсикантів (N·NH3, важкі метали тощо), але й пентахлорофенол. На це вказують дані про наближення до контрольного варіанта кривої 3, що відображає різні кінетичні зміни рівнів: росту мікрорганізмів-симбіонтів і РН, ЛЖК і N·NH3, лактату та активності ензимів (целюлази й амілази).

Порівнюючи з контрольним варіантом (кривою 1), слід зазначити, що динаміка інтенсивності метаболізму першої рубцевої змішаної мікробної популяції (сформованої на менш доступних біосубстратах) загалом відрізняється від другої (рис. 4) більш видовженою lag-фазою мікроорганізмів- симбіонтів і набагато пізнішим виходом на плато кінетичних кривих усіх досліджуваних показників. Передусім це стосується кривих, що відзеркалюють динаміку змін росту й розвитку мікробної популяції, рівня РН, утворення сумарної кількості ЛЖК, процесів амонієгенезу і лактатоутворення. Тут є вірогідно (р < 0,01) вищою целюлозолітична активність, що вказує на кращу пристосованість цієї мікробної популяції до утилізації клітковини, і саме дана (перша) популяція виявилась більш чутливою до ПХФ, ніж друга, що видно з чітко вираженого зниження (р.<.0,001) метаболічних процесів, які віддзеркалюються кривими змін рівнів росту мікробів, РН, ЛЖК і N·NH3, лактату та активності ензимів (целюлази й амілази). Це узгоджується з висновком про те, що більш розвинуті у даній популяції целюлозолітичні мікроби найбільш чутливі до дії токсиканта. Додавання кліноптилоліту в таке ж культуральне середовище посилює відновлення метаболічних процесів і навіть наближає їх до контрольного варіанта. Однак швидкість і рівень зняття депресуючої дії токсиканта все-таки чіткіше відмічаються при використанні другої мікробної популяції (сформованої на більш доступних біосубстратах), де, безперечно, домінують ті види мікроорганізмів, які є менш вразливими біоцидом.

Зміни активності інтрацелюлярних ензимів бактеріального комплексу рубця за дії біоциду та сорбенту. Активність всіх досліджуваних внутрішньоклітинних ензимів рубцевого бактеріального комплексу під дією ПХФ (40 МКМ) вірогідно (р.<.0,01) знижується. Причому активність малатдегідрогенази й ізоцитратдегідрогенази зменшується на 20?30 %, форміатдегідрогенази, малік-ензиму, аконітази й фумарази ? загалом у 2 рази, а лактатдегідрогенази - приблизно у 3 рази. Отже, такий сильний токсикант, як ПХФ, у дозі 40 МКМ гальмує всі реакції, які каталізуються вище переліченими ензимами, але не однаковою мірою. Це пояснюється тим, що бактеріальний комплекс рубця містить значну кількість різновидів бактерій, що по-різному реагуюють на біоцид, який інгібує не тільки екзоцелюлярні, але й внутрішньоклітинні ензиматичні реакції. Звідси випливає потреба у вивченні токсичної дії ПХФ на окремі чисті штами бактерій, які містяться в рубцевій екосистемі, зокрема на їх ензиматичні властивості.

При цьому важливо те, що додавання Кл вірогідно знижує (на 19?47 %, р.<.0,05) інгібуючу дію ПХФ на активність всіх досліджуваних ензимів рубцевого бактеріального комплексу. Однак повного повернення до початкового контрольного варіанта не спостерігається навіть у стійкіших бактерій, які сформувалися на більш доступних біосубстратах.

Особливості мікробного метаболізму в сліпій кишці свиней та кролів за дії екзогенних факторів. У товстій кишці ростучих свиней мікробна ферментація переважно складає приблизно 15 % від загального перетравлення органічної речовини, тоді як у свиноматок цей рівень може досягати навіть 50 % (Drochner W., 1993). Тут метаболізуються полісахариди і нітрогеновмісні сполуки, що надходять із тонкої кишки. В їх складі переважають незруйновані харчові протеїни, в тому числі рослинні білки низької розчинності (проламіни й глютеліни), протеїни ендогенного походження (ензими, секрети муцину й продукти деградації апоптозних клітин епітеліального й бактеріального походження тощо). Додатковими джерелами нітрогену є протеїни й нуклеїнові кислоти, що вивільняються з лізованих бактеріальних клітин. Загалом знання про процеси мікробного метаболізму в ШКТ, передусім у сліпій кишці свиней, кролів та інших тварин, за дії екзо- й ендогенних чинників залишаються недостатніми й суперечливими. Нами встановлено, що з багатьох досліджуваних джерел нітрогену й карбону в сліпій кишці свиней найменше метаболізується зеїн кукурудзяного зерна. Основним продуктом ферментації цих джерел є ацетат. Молярні відсотки розгалужених ЛЖК є нижчими у культурах, що містять субстрати муцин і РНК. Продукція лактату й метану також є нижчою при ферментації зеїну. Внесення у культуральне середовище ПХФ (40 МКМ) вірогідно знижує мікробний метаболізм при використанні всіх досліджуваних субстратів. Передусім про це свідчать характерні зміни рівнів продукції сумарної кількості ЛЖК та СН4. Додавання в інкубаційне середовище Кл вірогідно знижує (р.</0,05) інгібуючу дію біоциду. Очевидно, сорбент, звязуючи певну частину ПХФ та маючи багато інших властивостей сприяє частковому відновленню метаболічних процесів.

Поряд із цим, відмічаються певні його корективи у загальний процес становлення змішаної мікробної популяції. Найшвидше починають домінувати оцтовокислі та пропіоновокислі різновиди мікробів. Пропіонатпродукуючі мікроорганізми найкраще проявляють свою активність на таких субстратах, як глюкоза, РНК й муцин, а найгірше - на зеїні.

Роль мікробної популяції сліпої кишки у кролів вважається суттєво більшою, ніж у свиней, адже їх відносять до травоїдів. У наших експериментах виявлено, що на досліджуваних субстратах сумарна продукція ЛЖК є найбільшою при ферментації муцину, казеїну й глюкози, а найменшою - на зеїні. Гліадин та глютен займають проміжне місце. Тому за цим показником та продукцією N·NH3 і СН4 ми судили про доступність і поживну цінність досліджуваних біосубстратів для мікробів і тварини-господаря. А за спектром утворення індивідуальних коротколанцюгових карбонових кислот (С2?С5) можна отримати уявлення про життєдіяльність окремих різновидів мікробної популяції. Було виявлено, що ацетатпродукуючі мікроби є найбільш активними при ферментації усіх досліджуваних біосубстратів, але найактивніші вони за умов метаболізації РНК і муцину. Пропіонатпродукуючі мікроорганізми порівняно краще розвиваються на глюкозі, казеїні, муцині й глютені, а найгірше - на зеїні. За присутності останнього та глюкози порівняно краще функціонують бутиратутворюючі мікроби. Розгалужені жирні кислоти не утворюються у поживному середовищі з РНК.

Під впливом низьких доз ПХФ вірогідно (р <.0,01) зменшується сумарна продукція ЛЖК при зброджуванні усіх досліджуваних біосубстратів, але інгібування метаболізму стає значнішим при використанні менш доступних джерел вуглецю, нітрогену й енергії (зеїну, гліадину й глютену). При внесенні в інкубаційне середовище кліноптилолітового борошна гальмівна дія біоциду послаблюється, передусім на легкодоступних субстратах (муцині, глюкозі, казеїні й ріпаковому шроті). На різних біосубстратах по-різному відновлюють свою життєдіяльність ацетат-, пропіонат- і бутиратпродукуючі мікроорганізми. У середовищі з Кл концентрація N·NH3 на глюкозі навіть знижується у 2 рази. Таке явище пояснюється сорбційною та іонообмінною здатністю природного туфу щодо амоніаку і ПХФ. Тут слід вбачати подвійну позитивну роль Кл за присутності біоциду, адже при цьому біохімічні перетворення супроводжуються вірогідним (р </0,05) зростанням суми ЛЖК.

Метаболічні особливості клітин чистих штамів бактерій за дії екзогенних факторів. Основними мономерними одиницями вуглеводних компонентів рослинного світу є альдози - глюкоза (С5Н12О6; М.м.=180,16) і ксилоза (С5Н10О5; М.м.=150,14), а серед мікробів однією з найпоширеніших у ШКТ ссавців є цукролітична бактерія Butyrivibrio fibrisolvens. Кінетика утилізації глюкози і ксилози за умов дії ПХФ окремо та у присутності Кл у культуральному середовищі показана на рисунку 5.

Наведені та інші дані свідчать про те, що під впливом низької дози токсиканта гальмується ріст клітин і тільки на 5-7ій годинах ініціюється інтенсифікація їх накопичення. Але додавання Кл у середовище з ПХФ прискорює вказаний процес майже у 2 рази. Подібне спостерігається і при утилізації ксилози, однак це відбувається вірогідно повільніше (у 2,5 раза). Тут і дія ПХФ була сильнішою і протекторний вплив сорбенту - менш ефективним.

Дослідження стехіометрії метаболізму глюкози й ксилози клітинами B. fibrisolvens показали спільні ознаки та певні відмінності в кінцевому ефекті їх ферментації. На обох моноцукрах клітини цього штаму не проявляли фосфокетолазної активності, тоді як у нього та у контрольного штаму Lactobacillus plantarum 185 активність специфічної внутрішньоклітинної лактатдегідрогенази була відносно високою, а продукція кінцевих метаболітів задовільною. В окремих дослідженнях нами було встановлено, що у клітинах B. fibrisolvens 787 ще функціонують і такі специфічні ключові ензими, як 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолаза (КДФГА), завдяки якому мікроорганізми ефективно використовують метаболічний шлях Ентнера-Дудорова, та фруктозодифосфатальдолаза (ФДФА), за допомогою якої клітина здатна включати і напрям перетворень шляхом Ембдена-Мейєргофа-Парнаса.

Внесення в культуральне середовище навіть малих доз ПХФ вірогідно гальмує (р < 0,01) активність вищезгаданих ензимів та загальний метаболізм у клітинах B. fibrisolvens на досліджуваних субстратах. Однак, порівняно з глюкозою, на ксилозі та пектині таке гальмування є вірогідно (р.<.0,01) більшим. Відновлення активності досліджуваних ензимів та загального метаболізму в клітинах під впливом добавок сорбенту Кл відбувається значно ефективніше на глюкозі, ніж на ксилозі й пектині.