Влияние предшественника лей-энкефалина на активность ферментов обмена регуляторных пептидов головного мозга и периферических органов крыс в норме и при эмоционально-болевом стрессе - Диссертация

Ведущая роль в регуляции функций этих систем принадлежит нейропептидам, веществам, выступающим в организме в роли нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов [126, 134, 204, 221, 258]. Важную роль в адаптации организма к стрессу играют эндогенные биологически активные пептиды - компоненты стресс-лимитирующих систем: вещество Р, пептид, вызывающий дельта сон, энкефалины [27, 28, 69, 107, 110, 135, 152, 241]. Одной из наиболее универсальных стресс-лимитирующих систем, обеспечивающих адаптацию к изменениям, вызванным реакцией на действие экстремального фактора, является система эндогенных опиоидных пептидов [14, 103, 104, 116, 125, 266]. Уровень биологически активных пептидов, а, следовательно, и степень реализации ответной реакции физиологических и биохимических систем на воздействие стресс-фактора в значительной мере определяется активностью пептидгидролаз - ферментов, участвующих в образовании и/или деградации молекул регуляторных пептидов [20, 40, 71, 193, 209, 212, 218, 241, 256, 262]. Недавно появились сведения об участии в обмене регуляторных пептидов фермента, активность которого ингибируется фенилметилсульфонилфторидом - ФМСФ-ингибируемой КП [49, 53].Кроме того, было доказано, что один пептид может быть фактором регуляции, как частных метаболических реакций организма, так и глобальных форм системного поведения [29, 35, 51, 62, 199]. Более детальное изучение эффектов, проявляемых опиоидными пептидами, показало ряд значительных отличий в ответах организма на морфин и опиоидные пептиды [95, 133]. Показано, что, опиоидные пептиды способны оказывать воздействие на нейрональную активность [15, 139, 159, 198], память [96], поведение [51, 168, 199], участвовать в регуляции процессов восприятия боли [29, 86, 216, 266], эндокринных функций организма [93, 235], иммунных реакций [148, 167, 172, 173, 214, 244], стрессовых воздействий [14, 125, 238], сердечно-сосудистой деятельности [35, 115], вовлекаются в развитие и патогенез многих психических и неврологических заболеваний [32, 120, 129,134, 158, 253] и др. Из большого числа биологических свойств опиоидных пептидов особо следует выделить следующие: действие в весьма низких концентрациях, высокая селективность, отсутствие накопления в организме и низкая токсичность [3, 16]. Отмеченные свойства позволяют использовать опиоидные пептиды в комплексе терапевтических воздействий, направленных на повышение потенциальных возможностей организма при различных функциональных состояниях организма.Особого внимания в этой связи заслуживают основные КП, поскольку эти ферменты участвуют не только в конечной стадии образования активных пептидов, но и в начальных стадиях их деградации. Известно, также, что данный фермент может участвовать в начальных стадиях инактивации активных пептидов, содержащих остатки основных аминокислот с С-конца молекулы [40, 248]. Активность этой основной КП полностью ингибировалась фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ), в связи, с чем фермент был назван ФМСФ-ингибируемой КП [49]. Особенности тканевого и регионального распределения фермента позволяют отнести ФМСФ-ингибируемую КП, к ферментам, которые наряду с КПН вовлекается в обмен регуляторных пептидов [48, 53]. Известно, что важную роль в обмене таких биологически активных пептидов как энкефалины, ангиотензины, АКТГ, ПВДС, вещество Р и др. играет ангиотензинпревращающий фермент (АПФ), участвующий не только в процессинге, но и в инактивации активных форм пептидов [180, 182, 183].Изучение механизмов, по которым осуществляется регуляция активности ферментов, имеет большое практическое значение, так как предполагает управление течением процессов образования или деградации биологически активных пептидов. В настоящее время не вызывает сомнений, что активность КПН in vivo может регулироваься на уровне экспрессии гена [38, 202]. Тот факт, что влияние различных факторов не всегда согласовано и одинаково для экспрессии генов КПН и экспрессии нейропептидов, позволяет предположить, что регуляция на уровне экспрессии генов не единственный механизм, по которому осуществляется регуляция активности КПН. Однако тот факт, что в распределении активности между растворимой и мембраносвязанной формами в клетках с различным уровнем экспрессии и активности КПН нет различий [264], говорит в пользу того, что регуляция активности КПН на уровне превращения мембраносвязанной формы в растворимую невозможно [38].Таким образом, доказательств регуляции процессинга КПН в процессе созревания секреторных везикул нет. Так показано, что активность КПН in vitro ингибируется ее субстратами - мет5-энкефалин-арг6, лей5-энкефалин-арг6, мет5-энкефалин-лиз6, лей5-энкефалин-лиз6 [119, 193, 194, 205], а также продуктами каталитических реакций фермента - мет-и лей-энкефалином, арг-вазопрессином, веществом Р, тиротропин-рилизинг фактором [119, 193].Сегодня, стресс рассматривается как совокупность общих, неспецифических биохимических, физиологических и психических реакций организма, возникающих в ответ на действие чрезвычайных раздражителей различной п

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………...…………..………………...….5

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………..……………...……….6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…..……………..……………………...…11

1.1. Опиоидные пептиды и физиолого-биохимические аспекты их действия……………………………………………………...…………………11

1.2. Обмен регуляторных пептидов ………………………………..………..18

1.2.1. Биогенез нейропептидов………….......................................……….18

1.2.2. Механизмы регуляции активности ферментов обмена нейропептидов..………………………………………….…………..………..30

1.3. Опиоидные пептиды при воздействии стрессорных факторов..……...34

1.4. Ферменты обмена нейропептидов при стрессе………………….......…41

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…….…………48

2.1. Материалы исследования……………………………………..………....48

2.2. Методы исследования………………………………………..…………..49

2.2.1. Схема введения предшественника лей-энкефалина ……………...49

2.2.2. Моделирование острого эмоционально-болевого стресса……….49

2.2.3. Метод определения активности карбоксипептидазы Н……..……50

2.2.4. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы……………………………………………....……...…51

2.2.5. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента………………………………………………………………...…….51

2.2.6. Методы определения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vitro…………………………...……...……………………..……..52

2.2.7. Метод определения белка по Лоури………………..…...…………52

2.2.8. Статистическая обработка результатов исследования...………….52

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………….………….53

3.1. Региональное и тканевое распределение КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у самцов крыс..……………………………...…………………....53

3.1.1. Распределение активности КПН………………….……………...…53

3.1.2. Распределение активности АПФ………………………….………...54

3.1.3. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой КП ……...…...55

3.2. Исследование влияния острого эмоционально-болевого стресса на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и АПФ……56

3.2.1. Активность КПН в головном мозге надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса…….57

3.2.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в головном мозге надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса ……………..……………………………………..…....60

3.2.3 Активность АПФ в головном мозге надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса ……....62

3.3. Исследование влияния предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ…..………………... 65

3.3.1. Активность КПН в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг…………………………………...67

3.3.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалинарг..……69

3.3.3. Активность АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг……………….……...………...…72

3.4. Исследование влияния лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vitro…………………..………………..…..74

3.5. Исследование влияние лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и АПФ у крыс на фоне острого эмоционально-болевого стресса..........…..………...………………..…...75

3.5.1. Активность КПН при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса..…..…………………………………....77

3.5.2. Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса……………………………………………………………………....80

3.5.3. Активность АПФ при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса………........…………….………………84

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ…………88

ВЫВОДЫ……………………..…………………………………………...…114

ЛИТЕРАТУРА………………………………..………………………...…....116

ПРИЛОЖЕНИЕ…………….…………..…………………………...…….....146

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ