Властивості клонових ліній сортів картоплі після оздоровлення та культивування іn vitro - Автореферат

Нарівні із садивним матеріалом від добору клонів для відтворення еліти картоплі використовується також матеріал, отриманий з використанням біотехнологій: оздоровлений методом культури меристем та розмножений в умовах in vitro. Важливими умовами успішного використання біотехнологічних методів у насінництві картоплі є визначення терміну культивування оздоровлених клонових ліній in vitro та підвищення адаптивної здатності пробіркових рослин при переводі їх в умови in vivo, оскільки саме на цьому етапі втрачається значна кількість розсади (Адамова А.И. и др., 2002; Реуцкий В.Г. и др., 2005, 2007). Крім того, отриманню якісного насіннєвого матеріалу картоплі методом культури тканин перешкоджає також можливість контамінації мікророслин ендофітною бактеріальною мікрофлорою, в тому числі патогенною (Stead D., 1999), що може роками виживати в культурі тканин картоплі без ознак бактеріального ураження на рослинах, мікробульбах і не виявлятись у середовищі (Cassels Зважаючи на викладене, актуальним є вивчення розмаху і меж внутрішньосортової мінливості клонових ліній, отриманих в процесі оздоровлення сортів, а також її природи і стабільності в бульбових поколіннях. Дослідження виконані у відділі фітовірусології і біотехнології Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук впродовж 2002-2006 років у відповідності із завданнями науково-технічних програм УААН: “Фітовірусологічне обґрунтування та забезпечення оптимальних умов безвірусного насінництва сільськогосподарських культур в різних грунтово-кліматичних умовах України” (номер ДР 0101U003753), “Розробити технологію оздоровлення сортів картоплі біотехнологічними методами та наукові основи інтегрованого захисту оздоровленого матеріалу на всіх етапах відтворення еліти” (номер ДР 0104U005076), “Виробництво насіннєвого матеріалу картоплі культури in vitro” (номер ДР 0104U005077) та “Вдосконалити технології отримання оздоровленого вихідного насіннєвого матеріалу картоплі на основі біотехнологічних методів як базового етапу системи захисту картоплі від інфекцій” (номер ДР 0106U004288).В дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення важливого наукового завдання з визначення мінливості ліній при оздоровленні картоплі біотехнологічними методами та природи цієї мінливості, показано стабільність змін в бульбових поколіннях оздоровлених ліній. На основі скринінгу оздоровлених клонових ліній доведена можливість відбору ліній з однаковим морфотипом та істотно вищім, ніж у вихідних материнських клонів, проявом господарських ознак. Показано, що культивування клонових ліній картоплі шляхом послідовних живцювань in vitro понад 10 років призводить до повної втрати ними господарської цінності, а також може спричинювати зміни у структурній організації геномної ДНК цих ліній. Запропоновано циклічну схему культивування оздоровлених колекційних ліній in vitro до 3-х років та наступне поновлення шляхом ре-ініціації з бруньок кращих клонів цих ліній у першому бульбовому поколінні. Встановлено, що метаболіти мікроміцета Chaetomium cochliodes 3250 мають ауксинову, цитокінінову та гіберелінову активність, тому використання його культуральної рідини та самого гриба є екологічно безпечним способом стимуляції росту і розвитку картоплі в технології одержання вихідного матеріалу для покращення якості розсади як на етапі масового передпосадкового мікроклонального розмноження рослин, так і під час висадки пробіркових рослин в ґрунт теплиці або плівкових рулонів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення важливого наукового завдання з визначення мінливості ліній при оздоровленні картоплі біотехнологічними методами та природи цієї мінливості, показано стабільність змін в бульбових поколіннях оздоровлених ліній. На підставі цього доведена можливість виділення клонових ліній для поліпшення сортів картоплі при їх оздоровленні. Встановлено вплив тривалого культивування рослин in vitro на прояв у них морфологічних і господарських ознак. Доведено перспективність використання гриба-антагоніста C. cohliodes Palliser 3250 для підвищення адаптивності пробіркових рослин при пересадці їх у ґрунт. У ході проведених досліджень дійшли таких висновків: 1. Оздоровлення різних сортів картоплі біотехнологічними методами суттєво впливає на властивості отриманих клонових ліній. Встановлено мериклональну мінливість ліній за продуктивними, біохімічними та морфологічними ознаками. На частку фізіологічних змін, індукованих процесом оздоровлення як одного з чинників, що обумовлюють продуктивність клонових ліній, у першому бульбовому поколінні припадає 60-80%, у другому - 52-70% та у третьому - 25-46%. Низькопродуктивні лінії формували урожай на рівні 63-91% від урожаю вихідних материнських клонів, а високопродуктивні - 111-177%.

2. З використанням ДНК-аналізу методом RAPD встановлено, що зміни, які виявлені у меристемних ліній, отриманих із застосуванням хіміо- і термотерапії, не є результатом перебудови ДНК, а носять епігенетичний, або фізіологічний, характер. Результати дослідження з калюсними лініями свідчать про генетичну природу мінливості у них.

3. На основі скринінгу оздоровлених клонових ліній доведена можливість відбору ліній з однаковим морфотипом та істотно вищім, ніж у вихідних материнських клонів, проявом господарських ознак. Розроблена методика комплексної оцінки ліній при оздоровленні картоплі значно зменшує загрозу біологічного забруднення сортів.

4. Показано, що культивування клонових ліній картоплі шляхом послідовних живцювань in vitro понад 10 років призводить до повної втрати ними господарської цінності, а також може спричинювати зміни у структурній організації геномної ДНК цих ліній. Запропоновано циклічну схему культивування оздоровлених колекційних ліній in vitro до 3-х років та наступне поновлення шляхом ре-ініціації з бруньок кращих клонів цих ліній у першому бульбовому поколінні.

5. Встановлено, що метаболіти мікроміцета Chaetomium cochliodes 3250 мають ауксинову, цитокінінову та гіберелінову активність, тому використання його культуральної рідини та самого гриба є екологічно безпечним способом стимуляції росту і розвитку картоплі в технології одержання вихідного матеріалу для покращення якості розсади як на етапі масового передпосадкового мікроклонального розмноження рослин, так і під час висадки пробіркових рослин в ґрунт теплиці або плівкових рулонів. Внесення сумкоспор в грунт або передпосадкова обробка коріння мікророслин суспензією сумкоспор є доступними способами застосування гриба-антагоніста, який сприяє ефективній адаптації пробіркових рослин до ґрунтових умов.

6. Відхилення в рості і розвитку пробіркових рослин (калюсоподібні нарости на стеблах та листках, щіткоподібні корінці з потовщеннями на них) обумовлюються зміщенням біологічної рівноваги в системі рослина - асоціація ендофітних бактерій в умовах in vitro.

7. Встановлено, що бактерії, асоційовані з пробірковими рослинами картоплі, передаються бульбовими поколіннями цих рослин, як in vitro, так in vivo. Бактеризація впливає на рослини клонових ліній картоплі у широкому діапазоні, змінюючи їх морфологію, продуктивність та біохімічні показники бульб.

8. Виділені ізоляти ендофітних бактерій родів Bacillus та Pseudomonas інгібують патологічний процес, спричинений збудником мокрої гнилі картоплі. Тому проблему бактерій-ендофітів в пробірковому матеріалі можна розглядати як перспективу для створення in vitro штучних асоціацій ендофітів з рослинами, які сприятимуть підвищенню стійкості рослин до фітопатогенів в бульбових поколіннях.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Відбір типових високопродуктивних ліній для первинного насінництва дасть можливість запобігти появі змінених форм при оздоровленні і мікроклональному розмноженні сортів картоплі. Тому при отриманні оздоровленого вихідного матеріалу для первинного насінництва доцільним буде: - ініціація культури in vitro з меристемних верхівок бруньок зелених пагонів з одним-двома примордіями, недопущення калюсоутворення з експлантів та рослин-регенерантів з калюсу;

- бракування низькопродуктивних безвірусних ліній у першому бульбовому поколінні; ретельна перевірка відібраних високопродуктивних ліній у другому бульбовому поколінні на відповідність морфологічним та господарським ознакам вихідних материнських клонів із повним статистичним аналізом отриманих дворічних даних по кожній лінії;

- оформлення паспортів сортополіпшувальних оздоровлених ліній для передачі їх у лабораторії мікророзмноження або у колекції оздоровлених сортів.

2. Запропоновано оптимізовану схему підтримання колекцій оздоровлених ліній, яка гарантує збереження життєздатності і господарсько-цінних ознак сортів: - культивування ліній in vitro не більше трьох років із заміною або доповненням послідовного живцювання закритими циклами мікророзмноження (рослина - мікробульба у стані спокою - рослина);

- періодичне (не менше 1 разу в 3 роки) висаджування існуючих ліній в ґрунт із відновленням продуктивності цих ліній шляхом повторного введення in vitro тестованих пагонів кращих клонів у першому бульбовому поколінні;

- підтримання паралельної колекції бульбового матеріалу не старше рівня еліти та поповнення колекції новими високопродуктивними лініями.

3. Застосування культуральної рідини та живої культури (препарату хетоміка) мікроміцета С. cohliodes Palliser 3250 у виробництві вихідного матеріалу сприяє збільшенню коефіцієнта приживання розсади і продуктивності рослин (патент 68222А, акти впровадження).

1. Особливості вирощування картоплі в культурі in vitro / І. В. Демчук, О. М. Петренко, Л. П. Коломієць, С. П. Надкерничний, М. М. Зарицький // Наукові записки Тернопільського педуніверситеру. - 2002. - № 3 (18). - С. 205-209 (схеми експериментів, участь в отриманні та аналізі результатів, участь в написанні статті).

2. Демчук І. В. Вплив терміну культивування in vitro на властивості оздоровлених мікроклонів картоплі / І. В. Демчук // Аграрна наука і освіта. - 2007. - Т. 8, № 5-6. - С. 32-37.

3. Демчук І. В. Ефективність оздоровлення сортів картоплі біотехнологічними методами / І. В. Демчук, М. М. Зарицький // Сільськогосподарська мікробіологія. - Чернігів, 2007. - Вип. 6. - С. 155-166 (статистична обробка та аналіз результатів проведених експериментів, текст статті).

4. Демчук І. В. Використання мериклональної мінливості оздоровлених регенерантів для підвищення якості вихідного матеріалу картоплі / І. В. Демчук, О. М. Петренко, М. М. Зарицький // Сільськогосподарська мікробіологія. - Чернігів, 2005. - Вип. 1-2. - С.188-200 (участь в проведенні експериментів, статистична обробка та аналіз результатів, текст статті).

5. Демчинська М. І. Ендофітна мікрофлора культури тканин картоплі / М. І. Демчинська, І. В. Демчук // Сільськогосподарська мікробіологія. - Чернігів, 2005. - Вип. 3. - С. 123-134 (аналіз наукової літератури, участь в написанні статті).

6. Демчук І. В. Вплив бактерізації мікророслин картоплі на їх продуктивність в бульбових поколіннях / І. В. Демчук // Науковий вісник Ужгородського університету. - 2006. - Вип. 18. - С. 103-108.

7. Демчинська М. І. Бактерії-ендофіти в культурі тканин картоплі / М. І. Демчинська, І. В. Демчук, С. М. Мороз // Науковий вісник Ужгородського університету. - 2006. - Вип. 19. - С. 143-145 (виділення ізолятів, участь у написанні статті).

8. Демчук И. В. Изменчивость линий при оздоровлении сортов картофеля биотехнологическими методами / И. В. Демчук // Проблемы сельского хозяйства : междунар. сб. науч. тр. - Калининград: КГТУ, 2006. - С. 231-241.

9. Демчук И. В. О необходимости отбора высокопродуктивных линий при оздоровлении сортов картофеля биотехнологическими методами / И. В. Демчук, Е. Н. Петренко, Н. М. Зарицкий // Картофелеводство : сб. науч. тр. - Минск: РУП «Науч.-практ. центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству, 2007. - Т. 13. - С. 27-37 (участь в експериментах, статистична обробка та аналіз результатів, текст статті).

10. Пат. 68222 А Україна, A01G1/00, A01N63/00, C12N1/00. Процес виробництва насіннєвого матеріалу картоплі в культурі in vitro / Демчук І. В., Петренко О. М., Надкерничний С. П., Коломієць Л. П., Зарицький М. М.; заявник та патентовласник Інст.с-г.мікробіол. УААН. - № 20031110525 ; заявл.21.11.2003 ; опубл. 15.07.2004 ; Бюл. № 7 (аналіз наукової літератури, проведення досліджень, статистична обробка результатів, участь у написанні тексту)

11. Ендофітні бактерії, які спричинюють аномалії розвитку рослин картоплі при мікроклональному розмноженні / М. І. Демчинська, І. В. Демчук, О. М. Петренко, І. В. Волкова, С. М. Мороз : Збірник статей учасників міжнародної конференції [«Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія»], (Київ, 4 - 6 жовтня 2005 р.) / Національна академія наук України [та ін.]. - К., 2005. - С. 34-37 (участь в отриманні та аналізі результатів, текст статті).

12. Використання гриба-антагоніста Chaetomium cohliodes Palliser 3250 в технології виробництва вихідного матеріалу картоплі / І. В. Демчук, О. М. Петренко, С. П. Надкерничний, Л. П. Коломієць, І. М. Пінчук, М. М. Зарицький : Матеріали міжнародної науково-практичної конференції [«Інтегрований захист рослин на початку ХХІ століття»], (Київ, 2004 р.) / Українська академія аграрних наук, Інститут захисту рослин. - К., 2004. - С. 399-406 (схеми експериментів, участь в отриманні та аналізі результатів, текст статті).

13. Використання гриба-антагоніста Chaetomium cohliodes Palliser 3250 в технології виробництва вихідного матеріалу картоплі / І. В. Демчук, О. М. Петренко, С. П. Надкерничний, Л. П. Коломієць, І.М. Пінчук, М. М. Зарицький : Х зїзд Товариства мікробіологів України, (Одеса, 15-17 вересня 2004 р.) / Національна академія наук України [та ін.]. - Одеса, 2004. - С. 44 (проведення досліджень, текст).

14. Антивірусна терапія сортів картоплі / О. М. Петренко, І. В. Демчук, М. М. Зарицький, Л. П. Коломієць : IV Міжнародна конференція [«Біоресурси і віруси»], (Київ, 27-30 вересня 2004 р.) / Київський національний університет імені Тараса Шевченка. - К., 2004. - С. 90-91 (проведення частини досліджень, участь в написанні тексту).

15. Демчук І. В. Вплив терміну культивування in vitro на вихідні характеристики оздоровлених сорозразків картоплі / І. В. Демчук, О. М. Петренко : Тези доповідей ІХ конференції молодих дослідників, присвяченої 100-річчю від дня народження академіка АНУРСР і ВАСГНІЛ П. А. Власюка [«Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і ґрунтових мікроорганізмів»], (Київ, 24-25 лютого 2005 р.) / Інститут фізіології рослин і генетики НАН України. - К., 2005. - С. 70 (проведення досліджень, текст).

16. Демчук І. В. Мінливість регенерантів при оздоровленні сортів картоплі біотехнологічними методами / І. В. Демчук : Тези доповідей Першої міжнародної конференції студентів та аспірантів [«Молодь і поступ біології»], (Львів, 11-14 квітня 2005 р.) / Львівський національний університет імені Івана Франка. - Львів, 2005. - С. 124.

17. Демчук І. В. Вплив ендофітної мікрофлори на якість вихідного матеріалу картоплі / І. В. Демчук, О. М. Петренко, І. В. Волкова : Міжнародна конференція [«Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія»], (Київ, 4 - 6 жовтня 2005 р.) / Національна академія наук України [та ін.]. - К., 2005. - С. 15 (проведення досліджень, текст).

18. Природа ендофітних бактерій, які спричинюють захворювання мікроклональних рослин картоплі / М. І. Демчинська, І. В. Демчук, О. М. Петренко, І. В. Волкова, С. М. Мороз : Міжнародна конференція [«Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія»], (Київ, 4 - 6 жовтня 2005 р.) / Національна академія наук України [та ін.]. - К., 2005. - С. 16 (виділення ізолятів, фото, участь у частині досліджень та написанні тексту).

19. Демчук І. В. Комплексна оцінка ліній сортозразків картоплі, оздоровлених біотехнологічними методами / І. В. Демчук, М. М. Зарицький : Тези наукової конференції молодих учених [«Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології»], (Ужгород, 1-3 грудня 2005 р.) / Ужгородський національний університет [та ін.]. - Ужгород, 2005. - С. 44-45 (проведення та аналіз досліджень, текст).

20. Демчинська М. І. Мікробне забруднення експлантів картоплі під час ініціації культури in vitro / М. І. Демчинська, І. В. Демчук, С. М. Мороз : Тези наукової конференції молодих учених [«Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології»], (Ужгород, 1-3 грудня 2005 р.) / Ужгородський національний університет [та ін.]. - Ужгород, 2005. - С. 43-44 (виділення ізолятів, участь у написанні тексту).

21. Демчук И. В. Эндофитные бактерии, выделенные из растений культуры тканей картофеля и их влияние на качество исходного материала / И. В. Демчук, М. И. Демчинская, Н. М. Зарицкий : Тезисы докладов международной научной конференция [«Стратегия и тактика защиты растений»], (Минск, 28 февраля - 2 марта 2006 г.) / РУП «Інститут защиты растений» НАН Беларуси. - Минск, 2006. - Вып. 30, ч. 1. - C. 213-215 (проведення та аналіз досліджень, текст).

22. Мельничук Ф. С. Взаємовідносини між ендофітними бактеріями та збудником мякої гнилі картоплі / Ф. С. Мельничук, М. І. Демчинська, І. В. Демчук : Матеріали міжнародної науково-практичної конференції [«Інтегрований захист рослин. Проблеми та перспективи»], (Київ, 13-16 листопада 2006 р.) / Українська академія аграрних наук, Інститут захисту рослин. - К., 2006. - С. 144 (виділення ізолятів).

23. Демчук І. В. Зміна властивостей колекційних мікроклонів картоплі (Solanum tuberosum L.) за умов тривалого культивування in vitro / І. В. Демчук, О. М. Петренко, М. М. Зарицький : Тези доповідей ІІІ міжнародної конференції [«Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти»], (Львів, 4-6 жовтня 2007 р.) / Львівський національний університет імені Івана Франка [та ін.]. - Львів, 2007. - С. 66 (участь у проведенні досліджень, статистична обробка та аналіз результатів, текст).

24. Производство исходного семенного материала картофеля культуры in vitro / И. В. Демчук, Е. Н. Петренко, С. П. Надкерничный, Л. П. Коломиец, Н. М. Зарицкий // Инф. листок. - Чернигов : ЦНТЭИ. - 2003. - № 36 - 2 с. (проведення та аналіз досліджень, текст).