Властивості іонних струмів, що активуються ГАМК, в соматичній мембрані ізольованих нейронів спинальних гангліїв щурів - Автореферат

Мета роботи полягала у дослідженні біофізичних і фармакологічних властивостей ГАМКА-рецепторів на соматичній мембрані сенсорних нейронів. Головні задачі дослідження: З використанням методу фіксації потенціалу на мембрані цілої клітини та фрагменті мембрани вивчити характеристики іонних струмів, що виникають при швидкому прикладенні ГАМК на соматичну мембрану нейронів спинальних гангліїв щурів. Вперше вивчені властивості іонних струмів, що активуються ГАМК, в соматичній мембрані нейронів СГ щурів в умовах швидкого прикладання медіатора. На соматичній мембрані нейронів СГ вивчена чутливість ГАМКА-рецепторів щурів до блокатора - бікукулліна і показано, що бікукуллін у діапазоні концентрацій, що досліджувалися, впливає на амплітуду, але не впливає на кінетику іонних струмів, що активуються ГАМК. Визначена у дослідах відносно висока щільність іонних струмів, що активуються ГАМК, на сомі нейронів СГ дозволяє зробити припущення про вплив ГАМКЕРГІЧНОЇ системи на проведення сенсорних сигналів цими нейронами.В екпериментах використовувались щури лінії Вістар віком 12-15 днів, що утримувались на стандартній лабораторній дієті. Ганглії переносили у подвійне мінімальне середовіще Ігла (DMEM, Sigma, США), що містило 0,1% ферменту трипсину (Sigma, США) і витримували 15-20 хвилин при температурі 34ОС в термостаті. Після промивання проводилась механічна дисоціація тканини за допомогою Пастеровских піпеток з діаметром кінчика, що послідовно зменшувався. Суспензія клітин переносилася в чашку Петрі і ставилась у термостат при 34ОС на 60 хвилин для того, щоб клітини осіли та прикріпилися до дна експериментальної камери. Досліди проводили з використанням методу фіксації потенціалу на мембрані цілої клітини і на фрагменті мембрани.Швидка аплікація ГАМК (тривалістю 20 мс) на мембрану сенсорних нейронів щурів викликала трансмембраний іонний струм (рис.1 А), що зворотньо блокувався бікукулліном у концентрації 5 МКМ (рис.1 Б). Ділянка зростання іонного струму, що активується ГАМК, апроксимувалася двома експонентами зі сталими часу тзр1 (швідка експонента) і тзр2 (повільна експонента, рис. На рис.5А показані записи іонних струмів, що виникають при аплікації ГАМК у різних концентраціях на фрагмент мембрани нейронів СГ щурів. Стала часу першої експоненти (швидкої) не змінювалася при збільшенні концентрації ГАМК, тоді як стала часу другої експоненти (повільної) зменшувалася при збільшенні концентрації ГАМК зі значеннями, близькими до тих, що були отримані в конфігурації “ціла клітина” (рис. Ділянка спаду струму також апроксимувалася двома експонентами з різними сталими часу (тсп1=24±3 мс і тсп2=138±4 мс для концентрації 10 МКМ; тсп1=22±3 мс і тсп2=140±2 мс для концентрації 1 ММ; N=6; рис.З використанням методу фіксації потенціалу в умовах швидкого прикладення ГАМК досліджені біофізичні характеристики іонних струмів, що активуються ГАМК, на соматичній мембрані нейронів спинальних гангліїв щурів. Крива залежності максимальної амплітуди струму від концентрації ГАМК вірогідно описується рівнянням Хілла з параметром напівмаксимальної концентрації рівним 343 МКМ і коефіцієнтом Хілла рівним 2,79. Ділянки зростання та спаду іонних струмів, що активуються ГАМК, при короткочасному прикладенні агоніста мають складну кінетику, що описується двоекспоненційними функціями росту та спаду. Використання методу реєстрації струмів на фрагменті мембрани показує, що уповільнення кінетики росту струму обумовлене дифузними процесами на мембрані клітини, в той час як уповільнення кінетики спаду струму визначається фізіологічними властивостями ГАМКА-рецепторів. Отримані в роботі дані про біофізичні властивості ГАМКА-рецепторів на соматичній мембрані нейронів СГ щурів показують, що ці рецептори на нейронах СГ мають більше, ніж одну ділянку звязування ГАМК, і, на відміну від більшості ГАМКА-рецепторів у ЦНС, характеризуються низькою чутливістю до медіатора.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Характеристики іонних струмів, що активуються ГАМК, зареєстровані від цілої клітини.

Швидка аплікація ГАМК (тривалістю 20 мс) на мембрану сенсорних нейронів щурів викликала трансмембраний іонний струм (рис.1 А), що зворотньо блокувався бікукулліном у концентрації 5 МКМ (рис.1 Б). При зміщенні потенціалу, що підтримувався, від -80 МВ до 40 МВ виникала реверсія струмів із потенціалом реверсії -14 МВ (рис.1 В). Розрахований за рівнянням Нернста рівноважний потенціал для використанних концентрацій іонів хлору в позаклітинному та внутрішньоклітинному розчинах дорівнював - 19 МВ. Ці дані показують, що іонний струм виникав при відкривані хлорних каналів, повязаних із ГАМКА-рецепторами.

Залежность між амплітудою струму та концентрацією ГАМК у діапазоні від 10 до 1000 МКМ описувалася нелінійною функцією Хілла з параметрами ЕС50=343 МКМ і Nh=2,79 (рис.2). У нашій роботі вимірювався такий параметр, як час від початку аплікації речовини до точки максимальної амплітуди струму (час до піку, ЧДП). На рис.3А представлені нормалізовані записи струмів при аплікації ГАМК в концентраціях 10 МКМ, 100 МКМ та 1 ММ і графік залежності ЧДП від концентрації ГАМК. Видно, що при збільшенні концентрації агоніста ЧДП зменшувався (130±2 мс для Сгамк=10 МКМ; 64±4 мс для Сгамк=1 ММ, рис3Б). Ділянка зростання іонного струму, що активується ГАМК, апроксимувалася двома експонентами зі сталими часу тзр1 (швідка експонента) і тзр2 (повільна експонента, рис. 4А). На рис. 4Б показаний графік залежності сталих часу зростання швидкої (тзр1) та повільної(тзр2) експонент від концентрації ГАМК. Видно, що при збільшенні концентрації ГАМК величина тзр1 вірогідно не змінювалася, в той час як величина тзр2 зменшувалася від 47±2 мс (10 МКМ ГАМК) до 12±4 мс (1 ММ ГАМК). Спад струму, що активується ГАМК, апроксимувався двома експонентами зі сталими часу тсп1=15±3 мс і тсп2=125±4 мс. При збільшенні концентрації ГАМК показано, що обидві - швидка (тсп1) та повільна (тсп2) - експоненти вірогідно незмінюються (тсп1=12±3 мс для Сгамк=10 МКМ; тсп1=14±2 мс для Сгамк=1ММ і тсп2=130±2 мс для Сгамк=10МКМ; тсп2=126±5мс для Сгамк=1ММ; p=0,05, рис. 4 В,Г).

Характеристики струмів , що активуються ГАМК, зареєстровані від фрагменту мембрани.

Для усунення помилок, повязаних з дифузійними процесами на мембрані цілої клітини, частина дослідів проводилася на фрагменті мембрани. На рис.5А показані записи іонних струмів, що виникають при аплікації ГАМК у різних концентраціях на фрагмент мембрани нейронів СГ щурів. Ділянку зростання струму можна було задовільно апроксимувати двома експонентами з різними сталими часу (рис. 5А; N=6). Стала часу першої експоненти (швидкої) не змінювалася при збільшенні концентрації ГАМК, тоді як стала часу другої експоненти (повільної) зменшувалася при збільшенні концентрації ГАМК зі значеннями, близькими до тих, що були отримані в конфігурації “ціла клітина” (рис. 5Б; N=6).

Ділянка спаду струму також апроксимувалася двома експонентами з різними сталими часу (тсп1=24±3 мс і тсп2=138±4 мс для концентрації 10 МКМ; тсп1=22±3 мс і тсп2=140±2 мс для концентрації 1 ММ; N=6; рис. 5В). Як видно з діаграми на рис. 5Г, обидві величини не змінюються при збільшенні концентрації ГАМК.

Зміни в кінетиці іонних струмів, що активуються ГАМК, при тривалій аплікації ГАМК

Для дослідження властивостей іонного струму , що активується ГАМК, при довготривалому прикладенні агоніста тривалість аплікації збільшувалася з 10 до 500 мс. На рис. 6 А представлені записи іонних струмів із різною тривалістю прикладення ГАМК в концентраціях 100 МКМ (а) і 1 ММ (б). Максимальна амплітуда струму зростала зі збільшенням часу прикладення ГАМК (рис. 6 Б), однак при більших концентраціях агоніста спостерігався процес насичення струму, після якого зростання амплітуди припинялося, незважючи на аплікацію, що тривала. Було відзначено, що такий параметр, як ЧДП, також поводився подібним чином (рис. 6 В). Ділянка зростання струму, що активується ГАМК, задовільно апроксимувалася двома експонентами зі сталими часу тзр1 (швидка експонента) і тзр2 (повільна експонента) (рис. 7А1). При збільшенні тривалості аплікації ГАМК, параметр тзр1 не змінювався тоді як тзр2 помітно збільшувався (рис 7А2). В досліді з тривалим прикладенням ГАМК на фрагмент мембрани було визначено, що сталі часу першої та другої експонент зростання іонного струму не виявляють чутливості до зміни тривалості прикладення ГАМК (рис.7Б1 та рис.7 Б2; N=6).

Ділянка спаду іонного струму, що активується ГАМК, апроксимувалася двома експонентами зі сталими часу: тсп1=15±3 мс і сп2=68±2 мс на фрагменті мембрани та тсп1=17±2 мс і тсп2=130±3 мс на мембрані цілої клітини (рис.7 А3 та рис.7 Б3). Було виявлено, що при збільшенні тривалості прикладення ГАМК стала часу швидкої експоненти (тсп1) не змінювалася в обох методах. Стала часу повільної експоненти (тсп2) зростала до 158±4 мс для 500 мс аплікації ГАМК на фрагмент мембрани (рис.7 А4; Сгамк=500 МКМ, N=6) і до 178±5 мс для 500 мс аплікації ГАМК на цілу клітину (рис.7 Б4; Сгамк=500 МКМ, N=15).

Депресія іонних струмів при тривалій аплікації ГАМК.

Тривала аплікація ГАМК викликала також депресію іонного струму, що активується ГАМК. Зокрема, використання методики парного нанесення ГАМК з короткими інтервалами між аплікаціями показало, що при короткому (менш 500 мс) інтервалі спостерігається значне пригнічення струмів, (рис.8А,Б).

Довготривале прикладення високої концентрації ГАМК (1 ММ) також пригнічувало максимальну амплітуду іонного струму, що певно зумовлено десенситізацією ГАМК-чутливих рецепторів (рис.8В)

Вплив бікукулліну на кінетичні та амплітудні характеристики іонних струмів, що активуються ГАМК.

Дія бікукулліну в концентраціях від 10 НМ до 2 МКМ викликала зниження амплітуди іонного струму, індукованого швидкою аплікацією ГАМК в концентрації 500 МКМ на мембрану досліджуваних клітин, з 1,18±0,21 НА до 0,06±0,02 НА. На рівні концентрації бікукулліну 5 МКМ спостерігалося повне пригнічення струму, що активується ГАМК, яке відновлювалося при дії ГАМК після відмивання (рис. 9А). Залежність між амплітудою струму, що активується ГАМК, і концентрацією бікукулліну описувалося нелінійною функцією Хілла з параметрами ЕС50=203 НМ і Nh=1,0 (р<0,05; N=6, рис. 9Б). Ділянка спаду трансмембранного іонного струму, що викликається прикладенням ГАМК, описувалася двома експонентами зі сталими часу тсп1=37±3 мс і тсп2=179±14 мс (рис. 9В). При аплікації бікукулліну в діапазоні концентрацій від 10 НМ до 1МКМ не спостерігалося вірогідної зміни в сталих часу спаду тсп1 і тсп1 (рис.9Г).

В цих дослідах вивчався також такий параметр, як час від початку прикладення речовини до піку амплітуди іонного струму (ЧДП). При контрольній аплікації 500 МКМ ГАМК ЧДП складав 91±5 мс . Аплікація бікукулліну в концентраціях від 10 НМ до 2 МКМ також вірогідно не змінювала час до піку іонного струму, що активується ГАМК (10 НМ бікукулліну - 100±3 мс і 2 МКМ бікукулліну - 106±3 мс (рис. 9Д).

Щільність іонного струму, що активується ГАМК, в соматичній мембрані нейронів СГ щурів.

В усіх дослідах реєструвалася електрична ємність соматичної мембрани нейронів. За цими даними була розрахована щільність струму на одиницюелектричної ємності мембрани. На рис.10 показана щільність струму в одиницях ПА/ПФ при різних концентраціях ГАМК. За цим показником можна визначити, що середня щільність іонного струму, що активується ГАМК, на мембрані СГ щурів достатньо висока і наближається до щільності іонних струмів потенціалкерованих каналів (Fedulova S. A et. al., 1985; Safronov B.V. et. al., 1997).

Обговорення результатів досліджень

Досліджувані в нинішній роботі іонні струми, що виникають при швидкій аплікації ГАМК на мембрану сенсорних нейронів щурів, виявляють відомі характеристики струмів, що реєструються при аплікації ГАМК на клітини інших типів (Desarminen P. et al., 1984; Konink Y. D. and Mody I., 1994; Maconochie D. J et al., 1994; Jones M. V. and Westbrook G. L., 1995; MCCLELLAN A. M. and Twyman R. E., 1999). Потенціал реверсії іонних струмів та їхня чутливість до бікукулліну показують, що ці струми виникають внаслідок трансмембранного переносу іонів хлору через канали, повязані з ГАМК-рецепторами типу А. Збільшення концентрації агоніста викликало збільшення амплітуди струму, яке вірогідно описується функцією Хілла, що говорить про нелінійну характеристику взаємодії рецепторів з молекулами ГАМК при різних рівнях концентрації. Період від початку струму до його максимальної амплітуди екпоненційно зменшувався зі збільшенням концентрації ГАМК. При цьому апроксимація ділянки зростання струму показує, що зменшення часу до піку визначається здебільшого зменшенням сталої часу другої експоненти, в той час як стала часу першої експоненти не змінюється. Це дозволяє припустити перебіг двох процесів на мембрані клітини: перша, швидка експонента, відбиває швидкий процес, що не змінюється при підвищенні концентрації ГАМК, в той час як швидкість другого процесу залежить від зміни концентрації ГАМК. При збільшенні періоду прикладення медіатора, навпаки, стала часу другої експоненти збільшується, в цьому випадку вона напевно повязана з дифузійними процесами, зумовленими розливом медіатора та взаємодією його з віддаленими ділянками мембрани. В той же час швидкість першого процесу практично не змінюється при зміні тривалості прикладення агоніста. Спад струму, що активується ГАМК, демонструє також двохекспоненційну кінетику, при цьому визначено, що стала часу швидкої експоненти не змінюється при підвищенні концентрації або періоду прикладення ГАМК. Стала часу другої експоненти вірогідно не змінюється при підвищенні концентрації агоніста, але зростає при збільшенні часу його прикладення. При тривалій аплікації ГАМК спостерігається також депресія іонного струму, викликана, певно, переходом рецепторів у десинситизований стан (Higashi H. and Nishi S., 1982; Wei J. Z. and Vicini S., 1996; Galarreta M. and Hestrin S., 1997; Matthew I. B. et al., 1998). Перша експонента також показує помітну потенціалочутливість при зміні підтримуваного потенціалу в бік деполяризації мембрани.

В роботі проводилися кількісні оцінки впливу блокатора ГАМКА-рецепторів бікукулліну на іонні струми, що активуються ГАМК, в мембрані сенсорних нейронов СГ щурів. Залежність між концентрацією бікукулліну та його блокуючою дією на іонний струм, що активується ГАМК, вірогідно описується нелінійною функцією Хілла. Коефіцієнт Хілла, близький до одиниці, показує, що блокуюча дія бікукулліну виявляєтьсяпри звязуванні однієї молекули антагоніста з бікукуллін-чутливою ділянкою ГАМК-рецептора. Відсутність змін в таких параметрах, як часи зростання та спаду іонних струмів, показує, що бікукуллін не виявляє впливу на кінетичні механізми, які визначають активацію та деактивацію ГАМК-індукованого струму. Достатньо висока щільність ГАМК-рецепторів на соматичній мембрані нейронів СГ щурів дозволяє припустити можливість впливу на процес передачі сигналів з боку інших структур нервової системи через ГАМК-чутливі рецептори на сомі нейронів. Підвищення концентрації ГАМК поблизу мембрани нейронів СГ може викликати деполяризацію мембрани нейронів і зниження надійності проведення ПД в точці біфуркації відростка1. З використанням методу фіксації потенціалу в умовах швидкого прикладення ГАМК досліджені біофізичні характеристики іонних струмів, що активуються ГАМК, на соматичній мембрані нейронів спинальних гангліїв щурів.

2. Іонні струми, що активуються ГАМК, виникають внаслідок трансмембранного переносу іонів хлору через хемокеровані іонні канали, повязані з бікукуллін-чутливим ГАМК-рецептором типу А. Крива залежності максимальної амплітуди струму від концентрації ГАМК вірогідно описується рівнянням Хілла з параметром напівмаксимальної концентрації рівним 343 МКМ і коефіцієнтом Хілла рівним 2,79.

3. Ділянки зростання та спаду іонних струмів, що активуються ГАМК, при короткочасному прикладенні агоніста мають складну кінетику, що описується двоекспоненційними функціями росту та спаду. При цьому збільшення концентрації ГАМК призводить до прискорення кінетики активації струму за рахунок зменшення сталої часу другої експоненти.

4. Тривале прикладення ГАМК викликає уповільнення кінетики росту та спаду іонного струму. Використання методу реєстрації струмів на фрагменті мембрани показує, що уповільнення кінетики росту струму обумовлене дифузними процесами на мембрані клітини, в той час як уповільнення кінетики спаду струму визначається фізіологічними властивостями ГАМКА-рецепторів.

5. Отримана кількісна оцінка чутливості ГАМКА-рецепторів на соматичній мембрані нейронів СГ щурів до бікукулліну. Залежність блокуючої дії бікукулліну на іонний струм, що активується ГАМК, добре описується нелінійною функцією Хілла з напівмаксимальною концентрацією - 203 НМ і коефіцієнтом Хілла рівним 1.

6. Отримані в роботі дані про біофізичні властивості ГАМКА-рецепторів на соматичній мембрані нейронів СГ щурів показують, що ці рецептори на нейронах СГ мають більше, ніж одну ділянку звязування ГАМК, і, на відміну від більшості ГАМКА-рецепторів у ЦНС, характеризуються низькою чутливістю до медіатора.

7. Результати, що свідчать про відносно високу щільність ГАМКА- рецепторів на соматичній мембрані нейронів СГ, дозволяють припустити, що ГАМКЕРГІЧНА система має модулюючий вплив на нейрони, які передають сенсорну інформацію від периферичних структур до головного мозку.

Перелік праць, опублікованих за матеріалами дисертації

Статті: 1. Исаева О. В., Сидоренко В. Г., Федулова С. А., Веселовский Н. С. Вызванные тормозящие постсинаптические токи в динамике развития культивируемых нейронов гиппокампа крыс.// Нейрофизиология.- 1999.- т.31 - № 5.- с.370 - 376.

2. Сидоренко В.Г., Веселовский Н. С. Свойства ГАМК- индуцированных трансмембранных токов в изолированных нейронах спинальных ганглиев крыс. // Нейрофизиология.- 1999.- т.31 - № 6.- с.410 - 416.

3. Сидоренко В.Г., Веселовский Н. С. Действие бикукуллина на ГАМК-активируемые ионные токи в мембране нейронов спинальных ганглиев крыс. // Нейрофизиология.- 2000.- т.32 - № 4.- с. 300-303.

Тези доповіді: 1. Sidorenko V. Comparative characteristics of GABA-activated ionic currents in somatic membrane of rat DRG neurons // Neurophisiologia. -2000. -v.32. - №3. -р.180