Вивчення видоспецифічності поверхневих компонентів Mycobacterium kansasii - Автореферат

Захворювання, що спричинені мікобактеріями, у теперішній час не лише зберігають свою актуальність, але й мають тенденцію до неухильного поширення (Мельник В. М., 1997, Липкан Г.Н., 1999, Akita Y., et al., 1999). Туберкульоз в Україні, на думку багатьох спеціалістів, представляє собою національну небезпеку (Мельник В. М., 1997, Пухлик Б. М., 1999, Фещенко Ю.І., 2000), оскільки рівень захворюваності неухильно зростає і може вийти з-під контролю. На тлі зростання захворюваності на туберкульоз усе більшого значення в усьому світі набувають захворювання, спричинені атиповими мікобактеріями (Murray C. J. L., et al., 1990, Raviglione M. C., et al., 1995, Sherer R., et al., 1986). Найбільше значення може мати знаходження видоспецифічних компонентів серед поверхневих структур бактеріальної клітини, оскільки саме вони першими стикаються з імунною системою організму, до них, у першу чергу, формується імунна відповідь, що відкриває перспективу для своєчасної, високоспецифічної диагностики та визначає напрямок наших досліджень. Окремі частини дисертаційної роботи були фрагментами планових наукових робіт Одеського інституту клінічної біохімії та санітарії тварин УААН № 01.01.02 "Ідентифікувати, виділити та вивчити специфічні детермінанти мікобактерій туберкульозу” та № 01.06.2 "Вивчити антигенну структуру атипових мікобактерій з застосуванням ІФА-методів та виділити видоспецифічні антигени з метою розробки антигенних діагностикумів”.Було встановлено, що вміст нуклеїнових кислот в ектратах при застосуванні пропонованої нами методики екстрагування не був значним, причому визначалася виключно РНК, ДНК ж не була виявлена жодного разу. Встановлено, що послідовне застосування ДСН та тритону Х-100 сприяє екстрагуванню з бактерійної маси Mycobacterium kansasii максимальної кількості антигенних компонентів - 4 (за даними РПГ), що більше, ніж у випадку використання кожного з ПАР окремо. В середньому екстракти різних видів мікобактерій містили 20 - 30 електрофоретичних фракцій (електрофореграми екстрактів Mycobacterium kansasii - 17 фракцій), причому серед них можна було помітити деяки "характерні" за розташуванням, тобто за електрофоретичною рухливістю. Загалом же, електрофоретичне дослідження екстрактів дозволило підтвердити припущення про багатокомпонентний їх склад, тому треба було розділити екстракти на окремі фракції з препаративною метою. При цьому, як це можна бачити з рисунка 1, екстракти Mycobacterium kansasii розділяються на три основні групи фракцій: група "А" - компоненти, що здатні адсорбуватися на колонці лише за умов зниження концентрації вихідного буферного розчину до 0,05 М; група "В" - компоненти, що адсорбуються при 0,1 М концентрації вихідного буферного розчину з 0,2 М хлоридом натрію і елюціюються при поступовому підвищенні концентрації хлориду натрію до 1М; група "С" - компоненти, що могли бути елюційовані лише завдяки використанню розчину лугу - 1н. гідроксиду натрію.Екстракт Mycobacterium kansasii в результаті електрофорезу в поліакриламідному гелі розділяється на 17 компонентів, які відрізняються електрофоретичною рухомістю. Порівняння електрофоретичних картин розділення екстрактів Mycobacterium kansasii, Mycobacterium bovis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium phlei вказує, що в електрофоретичному спектрі Mycobacterium kansasii можна виділити 6 компонентів, які за своєю молекулярною масою та електрофоретичною рухомістю є характерними для цього мікроорганізму та можуть бути використані для ідентифікації електрофоретичного спектру Mycobacterium kansasii. Екстракт Mycobacterium kansasii методом колоночної іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі й наступної рехроматографії розділяється на 10 фракцій, котрі відрізняються міцністю звязку з іонообмінником та хімічним складом. За даними електрофорезу в поліакриламідному гелі компоненти фракцій відрізняються молекулярною масою, а в реакції преципітації у гелі проявляють неоднакові антигенні властивості. Такі компоненти знаходяться у фракціях В4 (елююється при концентрації хлориду натрію 0,75 М) та С1 (елююється при РН буферного розчину до 8,9) і є речовинами білкової природи з молекулярною масою в межах 72 - 86 КДА, які містять вуглеводний та ліпідний компоненти.

Дослідження умов екстрагування поверхневих компонентів Mycobacterium kansasii

Досліджували вплив ДСН, тритону Х-100, холату натрію та твіну-80 на екстрагування клітинних компонентів Mycobacterium kansasii. Експерименти у цьому напрямку вели за однаковою схемою: вивчали вихід білку при концентраціях нижчих за ККМ, дорівнюючих ККМ та вищих ККМ. Зясовано, що найбільший вихід білку спостерігається при застосуванні ДСН та тритону Х-100. При цьому оптимальними виявилися концентрація ДСН 0,5 % и РН 6,8 та концентрація тритону Х-100 - 0,4% (вага/обєм) и РН 7,0. Максимальна ж концентрація білку складає відповідно 200 мкг. см-3 та 180 мкг. см-3. Холат натрію та твін-80 забезпечують вихід білку у концентраціях не вищих, ніж 10 мкг. см-3.

Вивчено можливість послідовного застосування найбільш активних детергентів. Для цього спочатку проводили екстрагування ДСН, після чого бактеріальну масу обробляли 0,4 % розчином тритону Х-100 в 0,15 М трис-HCL буферному розчині РН 7,0. Завдяки цьому вдавалося додатково екстрагувати білок у кількості 50 мкг. см-3 экстракта.

Неушкодженість бактеріальних клітин протягом екстрагування доводили шляхом забарвлювання за Цілем-Нільсеном з подальшим мікроскопічним вивченням. При цьому було встановлено, що клітини мікобактерій навіть після послідовного застосування детергентів не втрачають кислотостійкости, що свідчить про неушкодженість клітинної стінки мікобактерій. Було встановлено, що вміст нуклеїнових кислот в ектратах при застосуванні пропонованої нами методики екстрагування не був значним, причому визначалася виключно РНК, ДНК ж не була виявлена жодного разу. Руйнування клітин повинне було б супроводжуватися значним виходом нуклеїнових кислот. Це також підтверджує неушкодженість клітин протягом екстрагування.

Таким чином, одержані екстракти Mycobacterium kansasii містять практично лише поверхневі компоненти й не мають суттєвої домішки внутрішньоклітинних компонентів.

Антигенні властивості отриманих екстрактів досліджували в реакції преципітації у гелі. При цьому було встановлено, по-перше, що обробка ДСН не спричинює втрати екстрактами антигенних властивостей (або вони відновлюються) після видалення цього детергенту. По-друге, екстрагування в різних випадках ДСН чи тритоном Х-100 дозволяє вивільнювати різні антигенні компоненти. По-третє, естракти, одержані з використанням холату натрію та твіну-80 антигенних компонентів не містили. Водночас, послідовне застосування ДСН та тритону Х-100 дозволяє вивільнити максимальну кількість антигенних компонентів. Встановлено, що послідовне застосування ДСН та тритону Х-100 сприяє екстрагуванню з бактерійної маси Mycobacterium kansasii максимальної кількості антигенних компонентів - 4 (за даними РПГ), що більше, ніж у випадку використання кожного з ПАР окремо.

Таким чином, послідовне застосування ДСН та тритону Х-100 призводить до найбільш ефективної солюбілізації антигненних поверхневих компонентів.

Результати розділення екстратів Mycobacterium kansasii методом електрофорезу в поліакриламідному гелі

Склад екстрактів різних видів мікобактерій досліджували методом електрофорезу в поліакриламідному гелі. Наступне порівняння електрофоретичних картин розділення екстрактів Mycobacterium kansasii, Mycobacterium bovis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium intracellulare та Mycobacterium phlei дозволило встановити, що бактеріопротеїни розташовуються на фореграмах у широкому диапазоні - від 205 КД до 14 КД і менше. В середньому екстракти різних видів мікобактерій містили 20 - 30 електрофоретичних фракцій (електрофореграми екстрактів Mycobacterium kansasii - 17 фракцій), причому серед них можна було помітити деяки "характерні" за розташуванням, тобто за електрофоретичною рухливістю. Зокрема, електрофореграма екстракту Mycobacterium kansasii вміщує 6 таких фракцій. Наявність у складі екстракту Mycobacterium kansasii "характерних" фракцій може дозволити ідентифікувати цей мікроорганізм за його електрофореграмою. Загалом же, електрофоретичне дослідження екстрактів дозволило підтвердити припущення про багатокомпонентний їх склад, тому треба було розділити екстракти на окремі фракції з препаративною метою.

Дослідження фізико-хімічних властивостей екстрактів мікобактерій, розділених методом іонообмінної хроматографії

Спочатку були проведені дослідження оптимальних умов розділення екстрактів мікобактерй на окремі фракції з використанням різних іонообмінників. Встановлено, що для первинного розділення отриманих нами екстрактів Mycobacterium kansasii оптимальним є використання ДЕАЕ-целюлози. При цьому, як це можна бачити з рисунка 1, екстракти Mycobacterium kansasii розділяються на три основні групи фракцій: група "А" - компоненти, що здатні адсорбуватися на колонці лише за умов зниження концентрації вихідного буферного розчину до 0,05 М; група "В" - компоненти, що адсорбуються при 0,1 М концентрації вихідного буферного розчину з 0,2 М хлоридом натрію і елюціюються при поступовому підвищенні концентрації хлориду натрію до 1М; група "С" - компоненти, що могли бути елюційовані лише завдяки використанню розчину лугу - 1н. гідроксиду натрію. Первинне розділення не дозволяє провести відокремлення деяких компонентів один від одного, тому проводили рехроматографію кожної групи фракцій з використанням "лінійного" градієнту концентрації хлориду натрію. Внаслідок рехроматографії було одержано 10 хроматографічних фракцій

Фракції досліджували спектрофотометричним методом з метою визначення наявності в них білку та інших складових. Було зясовано, що фракції різних груп не однакові за своїм кількісним та якісним складом, що демонструє таблиця 1.

З таблиці 1 можна бачити, що вміст нуклеїнових кислот, зокрема РНК, не корелює зі вмістом білку. Майже вся кількість цієї нуклеїнової кислоти зосереджується у фракціях групи "С". На нашу думку, такий характер перерозподілу РНК є гарантією остаточного очищення білка в іншіх фракціях від цієї нуклеїнової кислоти. Вірогідно, РНК у цих фракціях звязана з білком, тобто там містяться рибонуклеопротеїди. Відсутність же ДНК у складі фракцій ще раз свідчить про те, що її не було в екстракті, тобто суттєвого руйнування клітин у процесі екстрагування не відбувається.

Оскільки екстракти, крім білку та нуклеїнових кислот могли містити речовини іншої хімічної природи, ми провели дослідження хроматографічних фракцій методом тонкошарової хроматографії із застосуванням різних реагентів для "проявки" хроматограм. Було встановлено, що суцільні екстракти Mycobacterium kansasii містять речовини вуглеводної та ліпідної природи, однак розподіл таких речовин між хроматографічними фракціями неоднаковий. Вуглеводні компоненти містилися як у фракціях групи "А”, так "В”, і "С”. Це дозволяє припустити, що у всіх цих фракціях наявні глікопротеїди. Компоненти ліпідної природи були зосереджені лише у фракціях В2, В4 и В5. Це дає певні підстави вважати, що у цих фракціях знаходяться, переважно, ліпопротеїди.

Електрофоретичне розділення одержаних хроматографічних фракцій дозволило зясувати, що електрофоретична рухливість більшості компонентів, які входять до складу фракцій, не змінюється в ході іонообмінної хроматографії. Однак розподіл бактеріопротеїнів між фракціями не був однаковим. Фракції А1, А2, В1, В4, С3 вміщували по одному компоненту, фракції В2, В3, В5, С1 - по два. Фракція С2 вміщувала навіть три компоненти. Були визначені молекулярні маси компонентів, що входили до складу хроматографічних фракцій.

Дослідження антигенної будови екстрактів Mycobacterium kansasii

Показано, що фракції А2, В2, В5, С2, С3, не були активними в РПГ. Більшість же імунологічно активних фракцій були антигенно неідентичними та містили компоненти, що могли вступати до перехресних реакцій з сироватками проти іншіх видів мікобактерій. Лише фракції В4 та С1 містили компоненти, що могли бути визнані видоспецифічними для Mycobacterium kansasii. Водночас, фракції В4 и С1 давали реакцію "часткової антигенної тотожності" стосовно одна до одної.

Методом імуноелектрофорезу в агарозному гелі в екстрактах Mycobacterium kansasii було виявлено девять антигенних компонентів, серед яких є такі, що визначаються лише сироваткою проти Mycobacterium kansasii, а також такі, що виявляються усіма сироватками, які були взяті до експерименту

Антигенні компоненти, які були присутні у хроматографічних фракціях А1, В1 и В3 екстракту Mycobacterium kansasii, присутні також і в екстрактах іншіх видів мікобактерій. Компоненти ж фракцій В4 и С1 були характерні лише для екстракту Mycobacterium kansasii і не реагували з жодною з узятих до експерименту сироваток проти мікобактерій (Mycobacterium avium-intracellulare; Mycobacterium bovis; Mycobacterium fortuitum; Mycobacterium phlei; Mycobacterium scrofulaceum; нормальна кроляча сироватка.

Дослідження антигенної специфічності компонентів фракцій з використанням моноспецифічних сироваток дозволило встановити, що, по-перше, моноспецифічні антисироватки "В4 и С1” спроможні виявити відповідні їм компоненти екстракту Mycobacterium kansasii серед екстрактів іншіх видів мікобактерій, по-друге, компоненти, що присутні у фракціях В4 и С1 між собою дають реакцію "неповної ідентичності", нарешті, компоненти В4 и С1 екстракту Mycobacterium kansasii виявляються спроможними до виявлення специфічних антитіл у сироватках лабораторних тварин.

Таким чином, можна вважати, що хроматографічні фракції В4 и С1 екстракту M. kansasii містили, щонайменше, один антигенний компонент, який за результатами проведених досліджень можна вважати видоспецифічним. Молекулярна маса цього компоненту знаходиться в межах 72 - 86 КД. Це речовина білкової природи, що, вірогідно, має вуглеводний або ліпідний компонент як простетичну групу. На основі хроматографичних фракций В4 и С1 екстракту M. kansasii в подальшому можливе створення препарату для діагностики мікобактеріозів, що спричинені цим мікроорганізмом.1. Розроблені метод та умови екстрагування поверхневих компонентів Mycobacterium kansasii шляхом використання детергентів з різними механізмами солюбілізуючої дії. Послідовне застосування ДСН в концентрації 0,5 % і тритона Х-100 в концентрації 0,4 % дозволяє екстрагувати з інактивованих фенолом мікобактерій більшу кількість антигенних компонентів, ніж застосування кожного з детергентів окремо. Одержані у такий спосіб екстракти Mycobacterium kansasii містять переважно поверхневі компоненти бактеріальних клітин, про що свідчить збереження мікобактеріями кислотостійкості та відсутність в екстрактах дезоксірибонуклеїнової кислоти.

2. Екстракти поверхневих компонентів Mycobacterium kansasii є багатокомпонентні системи, які вміщують, за даними тонкошарової хроматографії та електрофорезу в поліакриламідному гелі речовини білкової, ліпідної та полісахаридної природи.

3. Екстракт Mycobacterium kansasii в результаті електрофорезу в поліакриламідному гелі розділяється на 17 компонентів, які відрізняються електрофоретичною рухомістю. Порівняння електрофоретичних картин розділення екстрактів Mycobacterium kansasii, Mycobacterium bovis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium phlei вказує, що в електрофоретичному спектрі Mycobacterium kansasii можна виділити 6 компонентів, які за своєю молекулярною масою та електрофоретичною рухомістю є характерними для цього мікроорганізму та можуть бути використані для ідентифікації електрофоретичного спектру Mycobacterium kansasii.

4. Екстракт Mycobacterium kansasii методом колоночної іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі й наступної рехроматографії розділяється на 10 фракцій, котрі відрізняються міцністю звязку з іонообмінником та хімічним складом. За даними електрофорезу в поліакриламідному гелі компоненти фракцій відрізняються молекулярною масою, а в реакції преципітації у гелі проявляють неоднакові антигенні властивості. Серед антигенних компонентів є як загальні для ряду фракцій, так і індивідуальні, що притаманні лише одній фракції.

5. Серед виділених фракцій виявлені антигени, які можуть бути визнані видоспецифічними для Mycobacterium kansasii. Видоспецифічність цих підтверджується в реакції преципітації в гелі та в імуноелектрофорезі, в тому числі, з використанням імунних сироваток, що були виснажені екстрактами Mycobacterium bovis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium avium-intracellulare, Mycobacterium phlei. Подібні антигени не зустрічаються в жодного з представників основних груп мікобактерій. Такі компоненти знаходяться у фракціях В4 (елююється при концентрації хлориду натрію 0,75 М) та С1 (елююється при РН буферного розчину до 8,9) і є речовинами білкової природи з молекулярною масою в межах 72 - 86 КДА, які містять вуглеводний та ліпідний компоненти. Обидва антигени дають реакцію неповної антигенної ідентичності один з одним в реакції преципітації у гелі.

6. Видоспецифічні компоненти Mycobacterium kansasii можуть служити основою для розробки тест-системи з метою покращення діагностики мікобактеріозів.

Перелік наукових робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Грузевский А.А. Современные данные о роли фотохромогенных микобактерий в патологии человека (Обзор литературы) // Проблемы туберкулеза. - 1999. - №6. - С.58 - 61.

2. Грузевський О.А. Вивчення видоспецифічних компонентів Mycobacterium kansasii за допомогою імунодифузійних методів // Буковинський медичний вісник. - 2000. - № 1. - С.170 - 174.

3. Протченко П.З., Грузевский А.А., Филиповский А.В., Александрова Л.Н. Изучение протеинового состава и антигенных свойств некоторых видов микобактерий // Експериментальна і клінічна медицина. - 1999. - №2. - С.75 - 78.

4. Грузевський О.А., Протченко П.З., Філіповський О.В. Вивчення протеїнових екстрактів деяких видів атипових мікобактерій методом іонообмінної хроматографії // Одеський медичний журнал. - 1999. - №4. - С.12 - 15.

5. Філіповський О.В., Протченко П.З., Грузевський О.А. Використання аніонного детергенту додецилсульфату натрію для екстракції поверхневих протеїнвмісних компонентів мікобактерій // Одеський медичний журнал. - 1999. - №3. - С. 19 - 21.

6. Грузевський О.А., Філіповський О.В. Виділення поверхневих протеїнових компонентів M. bovis та M. kansasii. // Нові технології у навчальному процесі, теоретичній та клінічній медицині (Додаток до "Одеського медичного журналу”). - 1999. - С.157-159.

7. Протченко П.З., Грузевський О.А., Філіповський О.В. Вивчення поверхневих видоспецифічних компонентів деяких видів атипових мікобактерій // Пленум Українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів ім.Д.К. Заболотного "Наукові та практичні аспекти боротьби з інфекціями в Україні на межі сторіч". Тези доповідей. - Одеса, 2000 р. - С.86-87.

8. Созінов В.О., Протченко П.З., Грузевський О.А., Александрова Л.М., Філіповський О.В. Дослідження протеїнового складу та антигенної структури деяких видів мікобактерій. // Актуальні проблеми мікробіології, епідеміології, паразитології та профілактики інфекційних хвороб. Тези доповідей XIII зїзду українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів ім.Д.К. Заболотного. - Київ - Вінниця, 1996. - С.139 - 140.

9. Грузевський О.А., Філіповський О.В. Антигенна структура та протеїновий склад деяких видів атипових мікобактерій // Науково-практична конференція молодих вчених та студентів, присвячена IV конгресу СФУЛТ. Тези доповідей. - Одеса, 1996. - C.8 - 10.