Вивчення участі продуктів метаболізму арахідонової кислоти у функціонуванні гепатоцитів щурів в культурі та кокультурі з клітинами купфера - Автореферат

Гепатоцити виконують основні метаболічні функції, такі як підтримка в організмі гомеостазу вуглеводів, білків та ліпідів, детоксикаційну та екзокринну функції. Серед клітин сполучної тканини ключове положення займають макрофаги печінки (клітини Купфера) - є високореактивні клітини, біологічні якості яких вар"юють в широких межах в залежності від конкретної ситуації, а тому вони мають унікальну можливість реагувати та миттєво включатися в регуляцію гомеостазу і розвиток патологічного процесу. Показано, що важливими ендогенними регуляторами функцій клітин печінки та медіаторами їх взаємодії є продукти метаболізму арахідонової кислоти, цитокіни, NO. Відомо, що печінка синтезує простагландини та лейкотрієни з арахідонової кислоти за циклооксигеназним та ліпоксигеназним шляхами метаболізму, відповідно[Huber M., 1990; Hagmann W., 1991; Kawada N., 1990; Meng X., 1994], а також є основним органом елімінації та деградації ейкозаноїдів системного походження [Brass E., 1988; Hagmann W., 1989; Keppler D., 1989; Leier I., 1992; Parthe S., 1990; Stene D., 1988; Shirley M, 1990; Shirley M., 1992; Tran-Thi T., 1994; Wettstein M., 1995; Wheelan P., 1995]. Підвищення рівня лейкотрієнів в печінці було показано на цілому ряді видів її ураження in vivo, а блокада синтезу лейкотрієнів призводила до суттєвого зменшення пошкождень, що свідчить про участь цих похідних арахідонової кислоти в розвитку патологічного процесу [Kawada N., 1990; Meng X., 1994; Agha

Результати дисертації викладені в 13 публікаціях: статті - 4, тези конференцій, сімпозиумів, з"їздів, пленумів - 9.

Обсяг та структура дисертації

Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень та їх обговорення, висновків, списку використаної літератури. Робота викладена на 131 сторінці, ілюстрована 22 рисунками і таблицею. Список літератури охоплює 280 джерел.

2. Основний зміст

Матеріали і методи

Об"єктом дослідження була первинна культура гепатоцитів, клітин Купфера та їх сумісна культура. Для отримання клітин печінки були використані дорослі самці щурів лінії Вістар масою 170-180 г та в деяких експериментах (дослідження дозозалежної дії блокаторів) - миші лінії СВА масою 18-20 г. Гепатоцити (Г) та клітини Купфера (КК) виділяли за допомогою двохетапної колагеназної перфузії з подальшим очищенням в градієнті густини Перколу. Клітини Купфера додатково очищали за допомогою адгезії. Ступінь очищення одержаних фракцій гепатоцитів оцінювали за морфологічними ознаками, клітин Купфера - за допомогою забарвлення суспензії клітин на пероксидазу та неспецифічну естеразу.

Культивування клітин проводили в оброблених колагеном планшетах для культур клітин (Sigma) в поживному середовищі RPMI 1640 з 15 ммоль HEPES, 15 % ембріональної телячої сироватки та антибіотиками (у 96-, 24- або 6-лункових планшетах в залежності від умов експерименту). Посадка клітин: 96-лунковий планшет - 4ґ104 Г на лунку та 4ґ105 КК на лунку, 24-лунковий планшет - 1ґ105 Г на лунку та 1ґ106 КК на лунку, 6-лунковий планшет - 1ґ106 Г на лунку. Через 3 години після посадки прикріплені гепатоцити відмивали шляхом заміни середовища. Для сумісного культивування до гепатоцитів додавали клітини Купфера в співвідношенні 1:10. Після 18 годин культивування при 37ОС у вологій камері з 5 % СО2 клітини відмивали, замінювали середовище інкубації на середовище RPMI 1640 без ембріональної телячої сироватки і інсуліну та здійснювали відповідні впливи, а саме: додавали нордігідрогуаяретову кислоту (НДГК) - блокатор ліпоксигенази; індометацин (ІНД)- блокатор циклооксигенази; бензилімідазол (БІА) - блокатор тромбоксансинтетази (кінцева концентрація блокаторів складала 2ґ10-5 моль). Розчинений в DMSO CCL4 додавали в культури гепатоцитів та кокультури гепатоцитів та клітин Купфера до кінцевої концентрації 5 ммоль через 30 хвилин після блокаторів.

Біохімічний аналіз культурального середовища (активність аланін-амінотрансферази в культуральному середовищі, синтез сечовини гепатоцитами, концентрація малонового діальдегіду, концентрація NO2-) проводили на протязі 24 годин. Активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій вимірювали через 4 та 24 години культивування після впливів.

Морфологічну оцінку культур проводили за допомогою світлової мікроскопії з використанням імерсійного об"єктиву ( х 100) на фіксованих ізопропанолом препаратах, забарвлених азур-еозином за Романовським.

Активність аланін-амінотрансферази (АЛТ) в культуральному середовищі визначали колориметричним методом в мікромодифікації [Коровкин Б.Ф., 1965]. Активність АЛТ виражали у ммоль пірувату/годґмл культурального середовища.

Активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів оцінювали за допомогою МТТ-тесту та виражали в умовних одиницях (У.О.), що відповідали значенню оптичної густини розчину формазану, утвореного в культивованих гепатоцитах (4ґ104 клітин) за одну годину, ґ 1000 [Reichner J., 1995].

Концентрацію сечовини в культуральному середовищі вимірювали колориметричним методом за допомогою тест-системи "Біо-Ла-Тест" (Брно). Кількість сечовини виражали в мкг/106 клітин.

Перекисне окислення ліпідів оцінювали за накопиченням в культуральному середовищі одного з кінцевих продуктів - малонового діальдегіду - колориметричним методом в мікромодифікації [Ohkawa H., 1979].

Продукцію NO оцінювали через визначення концентрації його метаболіта - NO2- в культуральному середовищі колориметричним методом з використанням реактива Грісса [Archer S., 1993].

Представлені дані є результатом трьох-шести незалежних експериментів для кожного показника. В кожному експерименті вплив досліджуваних речовин здійснювали паралельно в триплікатах культур клітин. Статистична обробка матеріалу проведена з обчисленням критерію Стьюдента для пар даних [Ойвин И., 1960].

3. Результати досліджень та їх обговорення

Проведена морфологічна та цитохімічна оцінка гепатоцитів та клітин Купфера свідчить, що клітини, використані для одержання культур, мали високий ступінь життєздатності та чистоти. Виділені клітини Купфера давали виражену специфічну реакцію на маркерні ферменти клітин макрофагально-моноцитарного ряду - неспецифічну естеразу та пероксидазу. Після початкового культивування первинна культура гепатоцитів мала вигляд моношару полігональних клітин, яку можна віднести до культур високої щільності. Гепатоцити, культивовані на протязі 24 годин, зберігали функції, притаманні їм in vivo.

На основі аналізу літератури та наших досліджень встановлена ефективна доза блокаторів ліпоксигеназного та циклооксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти - 2х10<-5 моль.>Зміни функціональної активності інтактних та уражених CCL4 гепатоцитів, культивованих окремо та сумісно з клітинами Купфера під впливом блокаторів метаболізму арахідонової кислоти за циклооксигеназним та ліпоксигеназним шляхами

Зміни активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в культурі і кокультурі

Як інтегральну характеристику фізіологічного стану гепатоцитів оцінювали активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій за МТТ-тестом. Результати, одержані за допомогою МТТ-тесту, корелюють з даними споживання клітинами кисню, одержаними полярографічним методом, що дає змогу використовувати МТТ-тест, як показник мітохондріального дихання [Klostergaard et.al., 1987]. Мітохондріальне дихання є основним, поряд з гліколізом, процесом, в ході якого генерується АТФ, що забезпечує енергією глюконеогенез в гепатоцитах, синтез сечовини, синтез білків, дію АТФАЗ та інші. В нормі активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій культивованих клітин була: гепатоцити - 64±4, 89±7 (У.О.), гепатоцити в кокультурі з клітинами Купфера - 109±6, 75±12 (У.О.) через 4 та 24 години культивування, відповідно. Виявлено, що в присутності НДГК цей показник суттєво підвищується через 4 години після впливу: в культурах гепатоцитів з 64±4 до 123±10 (У.О.), в кокультурах з 109±6 до 205±15 (У.О.), р<0,01 в усіх випадках. Після 24 годин культивування НДГК пригнічувала активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів, культивованих окремо з 89±7 (У.О.) в інтактних клітинах до 30±2 (У.О.) при дії блокатора (р<0,01). Імовірно, деякий рівень лейкотрієнів та інших продуктів ліпоксигенази є необхідним для тривалої підтримки функціонування гепатоцитів, а інгібіція ліпоксигенази на протязі 24 годин може призводити до зниження мітохондріальної активності. В той же час, при сумісному культивуванні гепатоцитів та клітин Купфера не виявлено вірогідного зниження активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій при тривалій блокаді ліпоксигенази; цей показник в інтактних культурах становив 75±12 У.О., при дії НДГК на протязі 24 годин - 58±8. Ці дані свідчать, що продукти ліпоксигенази відіграють фізіологічну ауторегулюючу роль по відношенню до мітохондріального дихання гепатоцитів і, таким чином, приймають участь в регуляції функціонального стану інтактних клітин.

Не виявлено вірогідних змін активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій при дії ІНД на культивовані клітини в усі терміни досліджень. Відсутність змін цієї загально-фізіологічної характеристики культивованих клітин може бути пов"язана з тим, що ІНД блокує синтез цілого ряду простагландинів, серед яких є як протективні, так і патогенетичні. Досліди з блокадою тромбоксансинтетази за допомогою БІА, проведені в 24-годинний термін, показали, що БІА, на відміну від ІНД, підвищує активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій культивованих гепатоцитів на 25 % по відношенню до інтактних клітин, р<0,05. Спостерігається деяке підвищення цього показника в кокультурі (на 16 %). Це свідчить про аутокринну down-регулюючу роль тромбоксану по відношенню до мітохондріального дихання гепатоцитів.

Виходячи з встановленої in vivo патогенетичної ролі лейкотрієнів, ми вивчали дію блокатора ліпоксигенази в умовах токсичного ураження гепатоцитів чотирихлористим вуглецем. СС14 (5 ммоль) пригнічував активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій культур гепатоцитів на 84 % через 4 години та на 90 % через 24 години після його застосування (р<0,01). В кокультурі цей показник також зменшувався на 88 % та 73 % через 4 та 24 години, відповідно (р<0,01, по відношенню до інтактних клітин). Блокада ліпоксигенази за допомогою НДГК запобігала викликаному СС14 порушенню функцій мітохондрій. Активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів, уражених СС14, збільшувалось в присутності НДГК з 10±2 до 81±6 (У.О.) на 4 годині та з 9±2 до 62±11 (У.О.) на 24 годині досліджень (р<0,01 в усіх випадках). Аналогічна картина спостерігалася в умовах сумісного культивування. В присутності НДГК активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в кокультурі, оброблених СС14, підвищувалась з 13±2 до 131±12 (У.О.) та з 20±5 до 65±7 (У.О.) через 4 та 24 години впливу блокатора, відповідно (р<0,01). Ці дані відносно протективної дії НДГК погоджуються з дослідами, проведеними in vivo, коли введення тваринам інгібіторів синтезу лейкотрієнів, зокрема НДГК, запобігало ушкодженню печінки СС14 [Reyes M., 1995; Perez-Alvarez V., 1993]. При цьому суттєво знижувався вихід цитозольних ферментів з гепатоцитів, а також рівень ПОЛ в печінці. Патогенетична роль лейкотрієнів показана в багатьох дослідженнях in vivo [Kawada N., 1990; Agha A., 1995; Hiroichi N., 1989; MCGUIRE G., 1996]. В цьому випадку їх дія може бути пов"язана з впливом на судини, з залученням нейтрофілів. Наші дані свідчать, що продукти ліпоксигенази можуть безпосередньо здійснювати ушкоджуючий вплив на гепатоцити, без участі систем органу та організму. Одним з механізмів прямої уражуючої дії лейкотрієнів чи інших продуктів ліпоксигенази на гепатоцити при їх підвищеному синтезі в умовах патології може бути пригнічення мітохондріального дихання клітин, оскільки блокада синтезу продуктів ліпоксигенази, за нашими даними, призводить до посилення активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів.

При дії ІНД в умовах застосування СС14 не було виявлено суттєвих змін активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій. На відміну від ІНД, блокатор тромбоксансинтетази - БІА проявляв виражену протективну дію, відновлюючи значення цього показника в гепатоцитах, культивованих окремо та сумісно з клітинами Купфера майже до рівня в інтактних культурах (р<0,05 по відношенню до дії СС14). Це свідчить про ушкоджуючу дію тромбоксану при токсичному ураженні культивованих клітин. Переважна більшість даних, пов"заних з впливом тромбоксану, отримані в системі in vivo. Показано, що блокада рецепторів до тромбоксану має протективну дію [Meng X., 1994; Engin A., 1995]. Отримані нами результати свідчать на користь того, що блокатор тромбоксансинтетази має протективний вплив при безпосередній дії на гепатоцити, що не опосередкована судинними та іншими реакціями.

В літературі є дані про те, що блокада одного шляху метаболізму арахідонової кислоти може призводити до посиленого утворення продуктів іншого шляху [Meng X., 1994; Griswold Don E., 1996]. Perez-Alvarez з співавторами [Perez-Alvarez V., 1993] вважають, що протективна дія інгібіторів синтезу лейкотрієнів на уражену печінку частково опосередковується збільшенням синтезу простагландинів. Можна припустити, що НДГК, інгібуючи ліпоксигеназу, посилює синтез простагландинів, частина з яких є цитопротективними, тобто захисний вплив НДГК опосередкований дією відповідних простагландинів. Ми, одночасно з блокадою ліпоксигенази за допомогою НДГК, блокували циклооксигеназу індометацином. Виявлено, що НДГК як сама по собі, так і при використанні сумісно з ІНД мала однакову дію на активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в нормі та при ураженні СС14, тобто дія НДГК на гепатоцити пов"язана саме з пригніченням утворення продуктів ліпоксигенази, а не з посиленням синтезу простагландинів.

Таким чином, наведені результати виявляють відмінність дії блокаторів ліпоксигенази та циклооксигенази на активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера в нормі та при ураженні СС14. НДГК суттєво змінювала цей показник, тоді як індометацин практично не впливав на нього. БІА, на відміну від індометацину, посилював активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій в нормі та при ураженні СС14. Була виявлена відмінність дії НДГК на інтактні та СС14-уражені клітини: активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій інтактних гепатоцитів при дії НДГК підвищувалась в 4-годинний термін та знижувалась в подальшому, тоді як в умовах дії СС14, НДГК поліпшувала функціональний стан мітохондрій гепатоцитів в усі терміни дослідженнь. Присутність клітин Купфера в культурі гепатоцитів запобігала зниженню активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій при дії НДГК на протязі 24-годин.

Зміни активності АЛТ в культуральному середовищі

Активність цитозольного ферменту гепатоцитів АЛТ в культуральному супернатанті відображає вихід ферменту з клітин в результаті їх ушкодження. Менший рівень АЛТ свідчить про більшу життєздатність гепатоцитів в культурі. Оскільки в первинній культурі гепатоцитів відбувається закономірний процес поступової деградації частини клітин, з часом спостерігається поступове збільшення активності АЛТ в середовищі.

Показано, що внесення НДГК в культуру гепатоцитів призводило до зменшення на 38 % виходу АЛТ з клітин через 24 години (р<0,01). Зниження активності АЛТ проявлялось в сумісній культурі вже через 4 години після впливу (на 29 % , р<0,05 по відношенню до контролю), та було вираженим через 16 та 24 години (р<0,01 в обох випадках). Ці дані свідчать, що продукти ліпоксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти здатні безпосередньо ушкоджувати гепатоцити. Не виявлено суттєвих змін активності АЛТ при дії ІНД та БІА на культивовані гепатоцити та кокультуру в фізіологічних умовах.

Введення СС14 (5 ммоль) в культуральне середовище призводило до токсичного ураження гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера. Це проявлялося в підвищенні активності АЛТ в супернатантах гепатоцитів на 88 %, на 130 % та 92 % через 4, 16 та 24 години, відповідно (р<0,01 по відношенню до інтактних клітин, в усіх випадках). В кокулькурі це підвищення складало 110 %, 119 % та 120 % через 4, 16 та 24 години, відповідно (р<0,01 по відношенню до інтактних клітин). В цих умовах НДГК проявляла виражену протективну дію, знижуючи рівень АЛТ в супернатантах культур гепатоцитів та їх кокультур в усі терміни дослідження (гепатоцити - на 44 %, 19 % та 25 % через 4, 16 та 24 години, р<0,05 по відношенню до клітин, уражених СС14; гепатоцити клітини Купфера - на 20 %, 41 % та 45 % через 4, 16 та 24 години, відповідно, р<0,05 по відношенню до клітин, уражених СС14). Виходячи з цього можна припустити, що НДГК, знижуючи рівень ендогенних продуктів ліпоксигенази в гепатоцитах, запобігає ушкоджуючій їх дії, що проявляється в підвищенні життєздатності культивованих гепатоцитів. Таким чином, в умовах патології лейкотрієни, напевно, можуть безпосередньо здійснювати ушкоджуючий вплив на гепатоцити.

ІНД не змінював вихід АЛТ з гепатоцитів. Хоча інгібіція циклооксигенази за допомогою ІНД не викликала змін життєздатності уражених гепатоцитів, блокада окремої ланки цього шляху - тромбоксансинтетази - за допомогою БІА мала суттєвий ефект. Показано, що БІА призводив до зменшення на 22 % виходу АЛТ з гепатоцитів, уражених СС14, через 24 години (р<0,05). Зниження активності АЛТ в супернатанті кокультур виявлялося вже через 4 години після впливу (на 36 %, р<0,05 по відношенню до гепатоцитів, уражених СС14), та було вираженим на 24-й годині дії БІА (на 28 % по відношенню до кокультур, уражених СС14, р<0,05).

Таким чином, була встановлена відмінність дії блокаторів ліпоксигенази та циклооксигенази на активність АЛТ в культуральному середовищі як в нормі, так і при ураженні СС14. НДГК знижувала цей показник, тоді як ІНД істотно не впливав на нього. В той же час БІА, блокатор тромбоксансинтетази, знижував активність АЛТ в культуральному середовищі гепатоцитів та кокультур в умовах дії СС14, що свідчить про ушкоджуючу дію тромбоксану при виникненні токсичного ураження. Протективна дія НДГК та БІА була більш вираженою в кокультурі гепатоцитів з клітинами Купфера, ніж в окремо культивованих гепатоцитах та проявлялася раніше.

Зміни синтезу сечовини гепатоцитами

Нами не було виявлено суттєвих змін синтезу сечовини гепатоцитами при дії блокатора ліпоксигенази НДГК, у той час як активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій клітин значно змінювалась. Це свідчить про спрямований регулюючий вплив, який мають продукти ліпоксигенази на різні функції гепатоцитів. На відміну від НДГК, ІНД знижував синтез сечовини на 30 % та на 20 % в нормі та при ураженні СС14, відповідно (р<0,05) при його дії на протязі 24 годин культивування. Ці дані свідчать про те, що сумарний вплив всіх продуктів циклооксигенази призводить до підвищення синтезу сечовини, здійснюючи, таким чином, регуляцію детоксикаційної функції печінки в нормі та при патології. При дії іншого блокатору метаболізму арахідонової кислоти за циклооксигеназним шляхом - БІА - також спостерігалося вірогідне зниження синтезу сечовини, тобто тромбоксан, напевно, грає up-регулюючу роль по відношенню до специфічної функції гепатоцитів - синтезу сечовини. Крім того, наші дані показують, що інгібуюча дія ІНД на синтез сечовини в значній мірі опосередкована зниженням синтезу тромбоксану.

Таким чином, було виявлено особливості дії блокаторів ліпоксигеназного та циклооксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти на синтез сечовини гепатоцитами: НДГК не впливав на цю функцію, тоді як індометацин та БІА пригнічували її. Виявлено також диференційовану дію ейкозаноїдів на різні функції гепатоцитів.

Зміни перекисного окислення ліпідів (ПОЛ)

Дія застосованих блокаторів ліпоксигенази та циклооксигенази є відносно специфічною. За деякими даними, НДГК та ряд інших блокаторів мають антиоксидантні властивості, тобто зменшують перекисне окислення ліпідів [Tang D., 1996]. Ми досліджували зміни інтенсивності процесів ПОЛ по накопиченню кінцевого продукту - малонового діальдегіду - в культуральних супернатантах від гепатоцитів при дії НДГК, ІНД та БІА. Цей показник є інформативним, оскільки показано, що 95 % МДА накопичується в зовнішньоклітинному середовищі культивованих гепатоцитів [Gunther T., 1995]. Наші дані свідчать, що всі використані блокатори знижують кількість МДА в культуральному середовищі від гепатоцитів. Хоча НДГК, ІНД та БІА знижують кількість МДА в східній мірі (на 46 %, 37 % та 27 %, відповідно), зміни виходу АЛТ з гепатоцитів та активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій виявляються тільки при дії НДГК та БІА, а зміни синтезу сечовини - тільки при дії ІНД та БІА. Ці дані свідчать, що вплив використаних блокаторів на функціональний стан гепатоцитів, в основному, обумовлений блокадою синтезу відповідних похідних арахідонової кислоти і в значно меншій мірі пов"язаний з притаманними блокаторам антиоксидантними властивостями та пригніченням ПОЛ.

Продукція оксиду азоту клітинами Купфера, культивованими окремо та сумісно з гепатоцитами

Досліджуючи механізми дії блокаторів метаболізму арахідонової кислоти, необхідно мати на увазі, що ця дія може бути опосередкована NO. Останнім часом широко дискутується питання про роль NO в функціонуванні печінки в нормі та при патології. В дослідах in vivo показана індукція NO при ураженні печінки мишей СС14 [Rockey D., 1997]. Показано, що викликана клітинами Купфера мітохондріальна дисфункція гепатомних клітин та гепатоцитів опосередкована, в значній мірі, дією NO [Fukumura D., 1996; Herbert K., 1989; Kurose I., 1996]. Є дані про уражуючий вплив NO на дихання мітохондрій гепатоцитів щурів in vitro [Fisch C., 1996]. Показане існування взаємозв"язку між синтезом ейкозаноїдів та NO [Harbrecht B., 1996; Harbrecht B., 1997; Rosa M., 1996]. Виходячи з цього, ми вважали доцільним виявити можливу участь NO в ефектах блокаторів синтезу ейкозаноїдів. Крім того, Studler з співавторами [Stadler J., 1995] показали, що в умовах підвищеного синтезу NO в гепатоцитах інгібується утворення сечовини, оскільки в даному випадку йде мова про конкуренцію за загальний субстрат L-аргінін. Важливо було встановити, чи опосередкована інгібуюча дія ІНД та БІА на синтез сечовини підвищеною продукцією NO. В окремій серії експериментів ми вимірювали рівень NO в культуральному середовищі при дії блокаторів на культивовані клітини. Продукція NO в інтактних Купферівських клітинах була незначною та складала 0,66±0,13 нмоль/106 клітин. В супернатантах окремо культивованих гепатоцитів NO2- в даних умовах не визначався. При сумісному культивуванні гепатоцитів та клітин Купфера цей показник був наближений до кількості NO2- в окремо культивованих клітинах Купфера. Не виявлено вірогідних змін концентрації NO2- при дії НДГК та ІНД, тобто виявлені нами ефекти блокаторів ліпоксигенази та циклооксигенази на функції гепатоцитів не опосередковані NO.

Особливості змін функціонального стану гепатоцитів в умовах їх кокультивування з клітинами Купфера

Вивчення змін функціонального стану гепатоцитів, культивованих сумісно з клітинами Купфера при дії блокаторів метаболізму арахідонової кислоти, дозволяє оцінити паракринну регулюючу роль продуктів, синтез яких блокується, у функціонуванні гепатоцитів.

Наші дослідження показали, що спрямованість змін досліджуваних показників при дії НДГК, ІНД та БІА була однаковою як в гепатоцитах, культивованих окремо, так і в гепатоцитах, культивованих сумісно з клітинами Купфера, в нормі і при ураженні клітин СС14. Це свідчить про те, що блокада синтезу простагландинів і лейкотрієнів в гепатоцитах і в клітинах Купфера призводить до східних результатів, тобто аутокринні та паракринні ефекти ейкозаноїдів подібні. Хоча зміни показників функцій гепатоцитів, культивованих окремо та сумісно з клітинами Купфера, якісно не відрізнялися, слід відмітити цілий ряд кількісних особливостей дії блокаторів в кокультурі порівняно з культурою гепатоцитів. Так, протективна дія НДГК на життєздатність гепатоцитів в нормі була більш вираженою в кокультурі та проявлялася раніш - вже в 4 годинний термін дослідження. Протективна дія НДГК та БІА в умовах ураження СС14 була також більш вираженою при сумісному культивуванні. Важливо відмітити, що статистично вірогідний інгібуючий ефект НДГК на активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій у 24-годинний термін дослідження був виявлений тільки в культурі гепатоцитів. Присутність клітин Купфера в культурі гепатоцитів в деякій мірі запобігала зниженню активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій. Поясненням цього явища може бути більша в кокультурі, ніж в культурі, кількість продуктів ліпоксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти, які, певно, приймають участь в підтримці функціонування клітин. З іншого боку, паракринні впливи клітин Купфера можуть забезпечувати більшу резистентність гепатоцитів до дії зовнішніх факторів.

Таким чином, сукупність отриманих даних свідчить про те, що продукти ліпоксигеназного та циклооксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти приймають участь в ауто- та паракринній регуляції функціонального стану гепатоцитів в нормі; блокада ліпоксигенази та тромбоксансинтетази має протективний ефект на гепатоцити, уражені чотирихлористим вуглецем.

Висновки

1 Простагландини і лейкотрієни є важливими регуляторами функцій печінки в фізіологічних умовах та при виникненні патологічних процесів. Більшість досліджень, пов"язаних з дією ейкозаноїдів, проведені in vivo, коли їх вплив може бути опосередкований змінами на органному рівні. Питання про безпосередній вплив простагландинів і лейкотрієнів на функціональний стан різних популяцій клітин печінки в нормі та при патології вивчене недостатньо.

2 Адекватною моделлю для вивчення безпосередньої участі простагландинів і лейкотрієнів в регуляції функціонування різних популяцій клітин печінки є культура клітин. Для вивчення ауто- та паракринних впливів ейкозаноїдів використали фармакологічний підхід, а саме впливали блокаторами окремих ланок метаболізму арахідонової кислоти (циклооксигенази, ліпоксигенази та тромбоксансинтетази) на гепатоцити, культивовані окремо і сумісно з клітинами Купфера в нормі та при їх ураженні CCL<4.>3 Встановлені особливості дії блокаторів метаболізму арахідонової кислоти на функціональний стан культивованих гепатоцитів щурів. Блокатор ліпоксигенази НДГК підвищує мітохондріальне дихання гепатоцитів (за даними активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій) у 4-годинний термін та знижує цей показник через 24 години, підвищує життєздатність гепатоцитів (за даними активності АЛТ в культуральному середовищі), але не впливає на синтез сечовини. Блокатор циклооксигенази ІНД знижує синтез сечовини в культивованих гепатоцитах, в той же час не викликає суттєвих змін їх життєздатності та функцій мітохондрій.

4 В умовах токсичного ураження виявлено протективний ефект НДГК, яка знижує рівень АЛТ в культуральному середовищі та запобігає пригніченню активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів, викликаному CCL4. ІНД в цих умовах не впливає на життєздатність та активність мітохондрій гепатоцитів.

5 Сумісне використання НДГК та ІНД має ті ж ефекти, що і НДГК сама по собі; це свідчить, що дія НДГК на гепатоцити не опосередкована підвищенням синтезу продуктів циклооксигенази при пригніченні ліпоксигенази.

6 Встановлено, що БІА, блокатор окремої ланки циклооксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти - тромбоксансинтетази, змінює функції гепатоцитів в нормі, підвищуючи активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій та знижуючи синтез сечовини. На відміну від ІНД, БІА проявляє виражену протективну дію в умовах ураження CCL4, знижуючи вихід АЛТ та підвищуючи активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів.

7 Встановлено, що виявлені особливості дії блокаторів на культивовані гепатоцити не опосередковані змінами синтезу NO та змінами ПОЛ.

8 Принципові закономірності змін показників функціональної активності гепатоцитів при дії блокаторів на кокультуру співпадають зі змінами в окремо культивованих гепатоцитах, однак протективна дія НДГК та БІА більш виражена в кокультурі. Присутність клітин Купфера в культурі гепатоцитів запобігає зниженню активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій кокультивованих клітин під впливом НДГК на 24 годині дослідження, що свідчить про паракринні стабілізуючі впливи клітин Купфера на гепатоцити.

9 Одержані дані вказують на те, що продукти ліпоксигенази є важливими ауто- та паракринними регуляторами функцій гепатоцитів, які впливають на неспецифічні показники функціональної активності клітин, такі як їх життєздатність та активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій. В той же час продукти циклооксигенази, зокрема тромбоксан, приймають участь в регуляції специфічної функції гепатоцитів, такої як синтез сечовини.

10 Виявлений протективний ефект блокади ліпоксигенази та тромбоксансинтетази в умовах ураження гепатоцитів CCL4 свідчить, що продукти ліпоксигенази та тромбоксансинтетази мають безпосередній ушкоджуючий вплив на гепатоцити при токсичному ураженні печінки, одним з механізмів ушкодження може бути пригнічення активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Статті: 1. Макогон Н.В., Лушнікова І.В., Ніконенко І.Р. Участь ендогенних ейкозаноїдів в функціональній активності клітин печінки мишей в культурі // Доповіді НАН.- 1996.- № 12.- С.176-179.

2. Лушнікова І.В., Корнійчук А.М., Макогон Н.В. Вплив чотирихлористого вуглецю на гепатоцити та клітини Купфера в культурі // Вісник Білоцерківського Держ.аграр.універс.-1998.- вип.6, ч.2.-С.171-174.

3. Makogon N., Lushnikova I., Korneitchuk A., Alexeyeva I. Effects of nordihydroguaiaretic acid and indomethacin on the viability and functional activities of normal and carbon tetrachloride-injured rat hepatocytes cultured alone and with Kupffer cells // Acta Physiol. Pharmacol. Bulg.- 1998.-V.23, N 2.- P.33-38.

4. Макогон Н.В., Лушнікова І.В., Алексєєва І.М., Корнійчук А.М. Вплив блокаторів циклооксигенази та тромбоксансинтетази на культивовані гепатоцити щурів в нормі та при ураженні чотирихлористим вуглецем // Експерим. та клінічна фізіол. і біохімія.- 1999.- № 2.- С.45-51

Тези: 1. Алексєєва І.М., Макогон Н.В., Лушнікова І.В. Зміни синтезу ДНК, РНК та білка в культивованих паренхіматозних та непаренхіматозних клітинах печінки при токсичному та імунному їх ураженні // В кн.: Клітинні та молекулярні механізми розвитку патологічних процесів.- Тез.доп. Пленуму науково-мед.тов-ва патофізіологів України (23-24 вересня 1993 р.), Львів.- 1993.- С.1.

2. Алексеева И.Н., Павлович С.И., Макогон Н.В., Лушникова И.В. Участие физиологически активных веществ, выделяемых клетками печени, в стимуляции и ингибиции иммунокомпетентных клеток // В кн.: Системно-антисистемная регуляция в норме и при патологии. - Науч.труды 3-го Международного симп. "Системно-антисистемная регуляция в живой и неживой природе" (10-13 ноября, 1993), Киев.- 1993.- С.76-80.

3. Алексєєва І.М., Макогон Н.В., Портниченко А.Г., Лушнікова І.В. Зміни активності імунокомпетентних клітин під впливом речовин, що виділяють паренхіматозні та непаренхіматозні клітини печінки // Тез.доповід. 14 з"їзді Укр.фізіол.тов.ім.І.П.Павлова, Київ.- 1994.- С.181.

4. Makogon N., Pavlovich S., Bryzgina T., Martynova T., Lushnikova I. Cultivated intact and injured mice liver cells produce substances which change the proliferation of immune cells // 12-th European immunology meeting, Barcelona.- 1994.- Р.346.

5. Павлович С.И., Портниченко А.Г., Лушникова И.В., Макогон Н.В., Никоненко И.Р. Влияние интактных и токсически поврежденных клеток печени в условиях блокады циклооксигеназы и липоксигеназы на иммунокомпетентные клетки // Тез.докл. І Российск. Конгр. по патофизиологии с междунар.участием, (Москва, 17-19 окт.).- 1996.- С.155-156.

6. Alexeyeva I., Makogon N., Lushnikova I., Nikonenko I. Lipoxygenase inhibitors influence viability and oxygen consumption of murine liver cells in primary culture // 10th International Confer. on prostaglandins and related Compounds, Vienna.- 1996.- Р.105.

7. Алексєєва І.Н., Макогон Н.В., Лушнікова І.В., Корнейчук А.М. Роль ейкозаноїдів в аутокринній та паракринній регуляції функцій клітин печінки в культурі // Тези докл. на ХУ з"їзді Укр.фізіол.тов. (Донецьк, 12-15 травня 1998 р.), Фізіол.журн.- 1998.- Т.44, № 3.- С.181.

8. Алексєєва І.Н., Бризгіна Т.М., Алексюк Л.І., Павлович С.І., Макогон Н.В., Мартинова Т.В., Портниченко А.Г., Лушнікова І.В., Корнійчук А.М., Сухіна В.С. Роль ейкозаноїдів в аутокринній і паракринній регуляції функцій клітин печінки та імунокомпетентних клітин за умов печінкової патології // Тези докл. на Пленумі тов.патофізіологів України (Чернівці, 20-22 травня 1998 р.), Фізіол.журн.- 1998.- Т.44, № 4.- С.52.

9. Alexeyeva I., Makogon N., Lushnikova I., Korneitchuk A. The influence of arachidonic acid metabolism inhibitors on some functions of normal and carbon tetrachloride-injured rat hepatocytes culrured alone and with Kupffer cells // XIIITH International Congress of Pharmacology (Munchen, 26-31 July, 1998).- 1998.- Р.R 351.