Вивчення імунобіологічних властивостей збудника та розробка інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби - Автореферат

Провідну роль в етіології пневмоентеритів телят відіграють збудники вірусної природи: інфекційного ринотрахеїту, парагрипу-3, вірусної діареї, парвовірусної та аденовірусної інфекцій великої рогатої худоби (ВРХ). Вірусна діарея займає особливе місце в інфекційній патології молодняку великої рогатої худоби, а на думку окремих дослідників вона відіграє провідну роль (Афонюшкин В.Н., 2004; Бабкін М.В., 1998; Білоконь В.С., 1970; Кучерявенко В.В., 2005; Кучерявенко Р.О., 1999; Стеценко А.В., 1999; Стеценко В.І. Мета роботи - вивчити імунобіологічні властивості збудника та розробити інактивовану вакцину проти вірусної діареї великої рогатої худоби. розроблено й впроваджено у виробництво інактивовану вакцину проти вірусної діареї великої рогатої худоби; Автором особисто проведено аналіз літературних даних за темою дисертаційної роботи; самостійно проведено аналіз епізоотичної ситуації щодо вірусної діареї ВРХ у світі; розроблені схеми проведення експериментів у лабораторних та виробничих умовах; виконано експериментальні та аналітичні дослідження; проведено аналіз та узагальнення отриманих результатів; сформульовано висновки та практичні пропозиції; підготовлено проект нормативної документації з виготовлення, контролю та застосування інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби.Але слід приймати до уваги, що не всі країни надають інформацію щодо кількості тварин, які були піддані вакцинації проти вірусної діареї великої рогатої худоби, тому ці показники можуть бути дещо занижені. За даними МЕБ, на 2004 рік епізоотична ситуація щодо вірусної діареї в Україні не визначена, але, за результатами досліджень співробітників ННЦ “ІЕКВМ”: Білоконь В.С., Кучерявенко В.В., Кучерявенко Р.О., Стеценко А.В., Стеценко В.І., Фісенко С.А., Чебанюк І.В., Чечоткіна Н.П., вірусна діарея має значне поширення на території нашої країни. Розробка технології виготовлення інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби передбачала вивчення біологічних властивостей вірусу, підбір оптимальної клітинної системи для культивування вірусу та найбільш активний в антигенному відношенні штам вірусу, оптимізацію умов культивування та інактивації збудника, підбір адюванту. Дослідженнями щодо визначення оптимальних умов та режиму культивування вірусу діареї було виявлено залежність рівня накопичення вірусу від ступеня виповнення моношару культури клітин при його інфікуванні та від дози інфікування культури клітин вірусом. У телят, яким було інокульовано вакцину з КЕ 10-01, титр антитіл до вірусу діареї підвищився до 6,0±0,3 log2 (Р ? 0,05) - на 4 log2 вище у порівнянні з титром до застосування вакцини, а у групі, в якій було використано адювант маркол, антитіла виявляли в титрах 5,2±0,6 log2 (Р ? 0,05), тобто вищих на 3,2 log2.На підставі аналізу даних про поширення вірусної діареї в світі, вивчення основних імунобіологічних властивостей (інфекційних, антигенних та імуногенних) епізоотичних (ВК-1, 25) та еталонного (Oregon C24V) штамів вірусу діареї великої рогатої худоби, відпрацювання оптимальних параметрів інактивації вірусу та підбору адюванту розроблено, випробувано в комісійному досліді та впроваджено у виробництво вакцину інактивовану проти вірусної діареї великої рогатої худоби (ТУ У 24.4-00497087-010:2006, реєстраційне посвідчення № 2511-04-0292-07). Вірусна діарея великої рогатої худоби зареєстровано в усіх частинах світу. При вивченні чутливості культур клітин НТ, ТРТ, КСТ, НВ до вірусу діареї встановлено їх різну чутливість до епізоотичних штамів ВК-1 і 25 та еталонного Oregon C 24 V. Найвищу інфекційність мав вірус діареї штам ВК-1, який накопичувався в культурі клітин КСТ у титрі (7,38±0,05) lg ТЦД50/см3 та ТТР у титрі 7,08±0,21 lg ТЦД50/см3. Застосування адюванту КЕ 10-01 у вакцині інактивованій проти вірусної діареї забезпечує найбільш виражені імуностимулюючі та пролонгуючі властивості, про що свідчить приріст на 4 log2 противірусних антитіл в організмі щеплених вакциною тварин та їх збереження в организмі тварин впродовж 6-ти місяців (термін спостереження).

Стан епізоотичної ситуації щодо вірусної діареї ВРХ у світі. Вірусна діарея має значне та нерівномірне поширення у світі, хворобу реєструють на всіх континентах. Найбільш поширена вона в Європі (35 країн) та Америці (26 країн). В Азії, згідно звітів МЕБ, більшість країн благополучні на вірусну діарею. Найменш зясована епізоотична ситуація в Африці, де за період 1996-2004 рр. у 14 з 47 країн не визначено статус щодо вірусної діареї. Стаціонарно неблагополучна щодо вірусної діареї великої рогатої худоби Австралія та Нова Зеландія. Результати проведеного аналізу свідчать про значне розповсюдження захворювання в економічно розвинених країнах Європи та Америки. З 46 країн Європи благополучними щодо вірусної діареї вважаються лише 5, а в Америці з 34 країн - лише 6.

За даними МЕБ, для боротьби з вірусною діареєю досить широко використовують вакцинацію тварин. У 1996 році щеплення проти вірусної діареї застосовувалось у 15 країнах, а у 2004 році кількість країн, які застосовують вакцинопрофілактику вірусної діареї, зросла до 22, що свідчило про зростання уваги в світі до цього захворювання. За період, що було проаналізовано, суттєво зросла загальна кількість тварин, які були вакциновані проти вірусної діареї. У 1996 році щеплено 111 426, а у 2004 році вже 13 818 153 тварин. Але слід приймати до уваги, що не всі країни надають інформацію щодо кількості тварин, які були піддані вакцинації проти вірусної діареї великої рогатої худоби, тому ці показники можуть бути дещо занижені. Так, відсутні дані про обсяги застосування вакцинації проти вірусної діареї великої рогатої худоби у таких країнах, як Аргентина, Болгарія, Канада, Німеччина , Корея, Нова Зеландія, Перу, Іспанія, Китай, Венесуела, Зімбабве, Ямайка та деяких інших. За даними МЕБ, на 2004 рік епізоотична ситуація щодо вірусної діареї в Україні не визначена, але, за результатами досліджень співробітників ННЦ “ІЕКВМ”: Білоконь В.С., Кучерявенко В.В., Кучерявенко Р.О., Стеценко А.В., Стеценко В.І., Фісенко С.А., Чебанюк І.В., Чечоткіна Н.П., вірусна діарея має значне поширення на території нашої країни.

Розробка технології виготовлення інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби. Розробка технології виготовлення інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби передбачала вивчення біологічних властивостей вірусу, підбір оптимальної клітинної системи для культивування вірусу та найбільш активний в антигенному відношенні штам вірусу, оптимізацію умов культивування та інактивації збудника, підбір адюванту.

Підбір штаму вірусу діареї та клітинних систем для його культивування. За результатами досліджень чутливості культур клітин до різних штамів вірусу діареї встановлено, що в культурах клітин ТРТ і КСТ на рівні 9-го пасажу забезпечувалось накопичення вірусу штамів ВК-1 та 25 у титрах (7,38±0,05) lg ТЦД50/см3 та (7,08±0,21) lg ТЦД50/см3, відповідно. Специфічність цитопатогенної дії підтверджено за допомогою РІФ та ПЛР, завдяки чому було визначено належність РНК досліджених вірусних штамів до вірусу діареї та відсутність контамінації вірусом культури клітин КСТ.

Дослідженнями щодо визначення оптимальних умов та режиму культивування вірусу діареї було виявлено залежність рівня накопичення вірусу від ступеня виповнення моношару культури клітин при його інфікуванні та від дози інфікування культури клітин вірусом. Встановлено, що вихід вірусу був найвищим за умов зараження в період найвищої мітотичної активності клітин - 7,4 lg ТЦД 50/см3 та 7,0 lg ТЦД 50/см3 для культур клітин КСТ та ТРТ відповідно та знижувався на 0,6-0,5 lg ТЦД50/см3 при інфікуванні культури у стаціонарній фазі росту клітин.

Експериментально доведено, що оптимальна множинність зараження культури клітин вірусом діареї складала - 0,1 - 0,01 ТЦД 50/клітину.

З метою відбору штаму-продуценту вивчено антигенну спорідненість та відмінності між різними штамами вірусу діареї. Для цього на кролях були отримані штамоспецифічні сироватки з активністю: до штаму ВК-1 - (6,25±0,25) log2, до штаму 25 - (5,0±0,04) log2, та до штаму Oregon C24V - (4,75±0,25) log2. Для постановки перехресної РН було використано штами вірусу діареї на рівні девятого пасажу: ВК-1 з титром 7,38 lg ТЦД50/см3; 25 з титром 7,08 lg ТЦД50/см3 та штам Oregon C24V з титром 6,55 lg ТЦД50/см3.

За результатами досліджень була встановлена ступінь антигенної спорідненості між дослідженими штамами: між ВК-1 і 25 - 87 %, між ВК-1 і Oregon C24V - 83 % та між Oregon C24V і 25 - 80 %. Антигенна відмінність для вищезазначених штамів складала: між ВК-1 і 25 - 4,9 %, між ВК-1 і Oregon C24V - 4,8 %, між Oregon C24V і 25 - 6,2 %.

Найвища антигенна спорідненість виявлена між штамами ВК-1 і 25 вірусу діареї. Антигенна відмінність між штамами ВК-1 і 25 та ВК-1 і Oregon C24V була майже на одному рівні - 4,9 та 4,8 %, відповідно. Отже, штам ВК-1 визначено найбільш антигенноспорідненним до польового та музейного штамів вірусу діареї, тому його обрали для подальших досліджень з розробки інактивованої вакцини.

За результатами досліджень встановлено оптимальну концентрацію формальдегіду для інактивації вірусу діареї, яка складала 0,1 % протягом 18 годин. Оскільки в інактивованій вакцині вірус повинен повністю втратити інфекційну активність, строк інактивації збільшено до 24 годин за температури 37 °С.

Вивчення імуногормональних взаємозвязків у динаміці формування поствакцинального імунітету. Стимуляцію імуногенезу з боку зростаючого рівня гормонів системи гіпофіз-щитовидна залоза у відповідь на антигенне навантаження кролів живим вірусом діареї визначали протягом 14-добового періоду. Відсутність стимуляції функціональної активності щитовидної залози тиреотропним гормоном гіпофізу вказує на прояв супресії клітинного та гуморального імунітету, що підтверджувалось низьким титром антитіл у щеплених тварин.

З метою зясування імуногормональних взаємозвязків було вивчено особливості глюкокортикоїдної функції гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи у кролів в динаміці формування поствакцинального імунітету при використанні інактивованого вірусу діареї.

Встановлено позитивний взаємозвязок між глюкокортикоїдним статусом тварин до вакцинації та рівнем антитілогенезу на 14-ту добу після ревакцинації. Рівень антитіл до вірусної діареї корелював з концентрацією кортизолу у сироватці крові.

Процес формування поствакцинального імунітету у кролів, щеплених двома варіантами вакцини з інактивованим вірусом діареї, не супроводжувався вірогідними змінами у глюкокортикоїдному статусі, що вказувало на відсутність супресорного впливу інактивованого вірусу на антитілогенез.

Вибір адюванту та його оптимального співвідношення з антигеном при розробці інактивованої вакцини проти вірусної діареї. З метою вибору ефективного адюванту були виготовлені зразки вакцини з вірусу діареї штаму ВК-1, інактивованого формаліном в кінцевій концентрації 0,1 %, та різних за складом та механізмом дії адьювантів: ГОА, КЕ 10-01, аеросилу, марколу та колоїдного заліза. Встановлено, що через 14-ть діб після другого введення зразків вакцини кролям найвищий рівень противірусних антитіл виявлено в групах, в яких застосовували препарат з КЕ 10-01 та ГОА, в титрі - 7,41 log2 та 7,0 log2, відповідно, а найнижчий - в групі з “колоїдним залізом”, який склав 5,83 log2. Динаміка гематологічних показників у крові кролів, щеплених зразками інактивованої вакцини, була позитивною і характеризувалася помірним лейкоцитозом вже на перше введення препарату.

Оскільки адюванти можуть стимулювати різні рівні накопичення антитіл у різних видів тварин, подальші досліди щодо підбору адюванту проводили на телятах.

У телят, двічі щеплених препаратом з ГОА, титр антитіл (АТ) через 14 діб після другого введення становив 4,0±0,3 log2 (Р ? 0,05), що на 2,2 log2 вище, ніж вихідний титр. У телят, яким було інокульовано вакцину з КЕ 10-01, титр антитіл до вірусу діареї підвищився до 6,0±0,3 log2 (Р ? 0,05) - на 4 log2 вище у порівнянні з титром до застосування вакцини, а у групі, в якій було використано адювант маркол, антитіла виявляли в титрах 5,2±0,6 log2 (Р ? 0,05), тобто вищих на 3,2 log2. У тварин контрольної групи сероконверсії до вірусу діареї не спостерігали протягом всього досліду. Отже, більш активну імунну відповідь стимулював зразок препарату з адювантом КЕ 10-01.

Для отримання максимального рівня противірусних антитіл при застосуванні інактивованої вакцини виникла необхідність визначити оптимальне співвідношення антигену та адюванту. Були виготовлені зразки, які вміщували 10, 20, 40, 60 та 80 % адюванту. Кожен зразок вводили дворазово з інтервалом 14 діб окремій групі з 5 морських свинок масою 300-400 г. Контролем були інтактні тварини-аналоги. Від тварин відбирали кров через 14, 21, 28, 35 та 42 доби після останнього введення препарату та отримували сироватку, в якій визначали титр противірусних антитіл. Результати дослідження наведені

Швидке падіння титрів противірусних антитіл у групах тварин, яким застосовували вакцину з 10 та 20 % адюванту, вказувало на недостатнє утворення депо препарату в місці введення або на швидке його розсмоктування. Застосування 40, 60 та 80 % адюванту в складі вакцини сприяло утворенню стабільного рівня противірусних антитіл в організмі тварин, який по групах суттєво відрізнявся, що, на нашу думку, було повязано зі зниженням вмісту антигену в складі вакцини.

За результатами вивчення біологічних властивостей вірусу, режимів культивування та інактивації вірусу діареї, підбору адюванту для виготовлення вакцини було відібрано штам ВК-1, інактивований формаліном при кінцевій концентрації 0,1 % з 40 % кремнійвміщуючого адюванту КЕ 10-01.

Вивчення імунобіологічних властивостей вакцини інактивованої проти вірусної діареї великої рогатої худоби. З метою вивчення властивостей вакцинного препарату нами визначено оптимальну імунізуючу дозу, біохімічні показники крові щеплених тварин, антигенні та імуногенні властивості вакцини при застосуванні на великій рогатій худобі різних вікових груп та фізіологічного стану у виробничих умовах.

Щеплення тварин у дозі 5 та 10 см3 викликало утворення високого рівня противірусних специфічних антитіл у тварин, але суттєвої різниці в напруженості імунітету між цими дослідними групами нами не було виявлено

У проведеному досліді встановлено, що найвищий рівень антитіл спостерігали в крові та молозиві щеплених проти вірусної діареї великої рогатої худоби тварин у день отелення (рис 3,4), який зберігався в крові щеплених тварин на рівні - 4,6±0,18 log2 протягом 6 місяців (термін спостереження). У молоці рівень специфічних антитіл до вірусу діареї поступово знижувався і практично зникав на 21-шу добу після отелення

При біохімічному дослідженні сироватки крові щеплених проти вірусної діареї корів було встановлено, що динаміка змін вмісту загального білка корелювала зі змінами рівня імуноглобулінів, про що свідчила кореляція з титром специфічних антитіл. При цьому концентрація альбумінів у сироватці крові щеплених тварин протягом експерименту вірогідно не відрізнялась від відповідних показників у контрольній групі та коливалась у межах 42,5- 49,0 г/дм3.

Отримані дані свідчили про активацію гуморальної ланки імунної системи у відповідь на дворазове введення вакцини інактивованої проти вірусної діареї, що супроводжувалось як підвищенням кількості загального білка та глобулінів, так і утворенням циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) середньої молекулярної маси в сироватці крові щеплених тварин. Починаючи з 14 доби, відмічали поступове зростання цього показника, яке тривало протягом всього експерименту, включно до 6 місяців після другого введення препарату. Отже, достовірне підвищення концентрації ЦІК через 14 діб після першого введення та 7, 14, 21-ну доби після другого введення складало 8,16; 18,40; 76,45; 43,00 та 27,73 %, відповідно.

Одним з важливих показників якості імунізуючого препарату є відсутність його імуносупресивного впливу на організм тварини. Одержані результати вказували на вірогідне зниження вмісту серомукоїдів у щеплених тварин відносно значень показника в контрольній групі вже на 7-у добу після першого введення препарату, а саме 10,61±0,67 мкг/см3 проти 12,68±0,60 мкг/см3. В подальшому рівень серомукоїдів у щеплених корів коливався у межах 9,69-14,06 мкг/см3, що було нижче контрольних значень в середньому на 8,52-26,43 %. Останнє дозволяло нам стверджувати, що введення вакцини не викликало збільшення кількості серомукоїдів у крові і свідчило про відсутність імуносупресивного впливу даного вакцинного препарату на організм щеплених тварин.

Удосконалення методу титрування вірусу діареї та реакції нейтралізації для визначення антитіл до вірусної діареї. Реакція нейтралізації є універсальним, високоспецифічним і чутливим тестом, та служить еталоном для оцінки інших реакцій у вірусології. З іншого боку вона трудомістка та потребує значних витрат матеріалів. За нашими спостереженнями проведення досліджень мікрометодом у порівнянні з класичною методикою постановки РН дозволяло скоротити витрати компонентів реакції у 5 разів та час на проведення досліджень у 8 разів.

За цих обставин було відпрацьовано й оптимізовано режими та умови вирощування клітин КСТ та ТРТ у мікропланшетах, техніку та облік результатів титрування вірусу, техніку постановки РН за мікрометодом для визначення титрів специфічних до ВД антитіл. Визначено оптимальну посівну концентрацію при вирощувані у мікропланшетах для клітин ТРТ та КСТ, яка склала 3 х 105 клітин/см3 поживного середовища. Вона забезпечувала формування рівномірного моношару клітин на 90-100 % впродовж 24±2 годин. Зниження посівної концентрації суттєво збільшувало строк формування моношару в лунках мікропланшет, а підвищення посівної концентрації до 4х105-5х105, хоча і скорочувало термін формування, але знижувала якість отриманого моношару.

При порівнянні результатів титрування мікрометодом та макрометодом нами було проведено визначення титрів 6-ти зразків вірусу діареї в культурі клітин КСТ за обома методами. Титр вірусу визначений за обома методами відрізнявся лише на 0,02 - 0,07 lg ТЦД50/см3. Статистичний аналіз отриманих даних підтвердив відсутність вірогідної різниці між титрами вірусу, які визначали за мікро- та макрометодами (Р>0.05).

Таким чином, нами було встановлено, що мікрометод титрування вірусу діареї є вірогідним і може бути використаний як базовий для проведення подальших дослідів.

Дослідженням 18-ти імунних сироваток великої рогатої худоби у реакції нейтралізації за мікро- та макрометодами не виявлено вірогідної різниці в результатах досліджень за цими методами (Р>0.05).

Вивчення терміну зберігання вакцини інактивованої проти вірусної діареї великої рогатої худоби. Під час зберігання вакцини термін її придатності вивчали за такими показниками: стерильність, нешкідливість, імуногенність, залишкова кількість формальдегіду, повнота інактивації вірусу та стабільність.

Аналіз отриманих результатів показав, що: - вакцина залишалась стерильною за весь термін зберігання за температури 4,0-8,0 °С;

- була нешкідливою для лабораторних тварин - усі піддослідні миші вижили;

- результати дослідження рівня імунної відповіді, яку індукувала вакцина, свідчили про її високу активність, яка дорівнювала 5,0 log2 , та зберігалась протягом 12-ти місяців (термін спостереження);

- при дослідженні повноти інактивації вірусу в складі вакцини, (протягом трьох послідовних пасажів у перещеплюваній культурі клітин) цитопатогенної дії вірусу не виявлено, що свідчило про повну його інактивацію і відповідало вимогам ТУ У;

- дослідженням стабільності вакцини встановлено, що при тривалому зберіганні вакцина частково розшаровувалась, але при легкому струшуванні утворювала гомогенну емульсію;

- доведено, що розроблена нами технологія виготовлення вакцини інактивованої проти вірусної діареї великої рогатої худоби забезпечувала отримання стерильного, нешкідливого та високоімуногенного препарату.

При дотриманні стандартних умов зберігання вакцина залишалась придатною до застосування протягом 12-ти місяців (термін спостереження) з моменту її виготовлення.

Визначення профілактичної ефективності вакцини проти вірусної діареї. Профілактичну ефективність вакцини оцінювали за рівнем загибелі телят, отриманих від щеплених корів та нетелей, у дослідному господарстві УААН. Після щеплення вакциною захворіло з ознаками діареї та загинуло до 6-місячного віку 6 новонароджених телят (2,4 %), у той час як у попередньому році, коли вакцину проти вірусної діареї не застосовували, загинуло з ознаками діареї 20 новонароджених телят, що складало 9,9 %.

З позитивними результатами вакцину випробувано для профілактики вірусної діареї у неблагополучному щодо вірусної діареї господарстві Полтавської області на поголівї понад 4000 голів великої рогатої худоби.

Максимальний титр антитіл в реакції нейтралізації отримано на 28-му добу після другого введення вакцини - 6,7 log2 у телят та 7,4 log2 у корів. В порівнянні з рівнем антитіл до щеплення він збільшився на 5,6 log2 і 5,4 log2, відповідно.

Збереженість телят зросла до 97,03 %, зменшилася кількість випадків респіраторно-шлункових захворювань, середньодобовий приріст маси тіла збільшився на 17 г, зменшилися економічні збитки в господарстві, що свідчить про значну профілактичну ефективність розробленої нами вакцини.

Отримані дані дають підставу рекомендувати схему імунізації великої рогатої худоби проти вірусної діареї, згідно якої вакцину вводять нетелям та глибокотільним коровам за два місяці до отелення та телятам - з 1 - 1,5 - місячного віку.1. На підставі аналізу даних про поширення вірусної діареї в світі, вивчення основних імунобіологічних властивостей (інфекційних, антигенних та імуногенних) епізоотичних (ВК-1, 25) та еталонного (Oregon C24V) штамів вірусу діареї великої рогатої худоби, відпрацювання оптимальних параметрів інактивації вірусу та підбору адюванту розроблено, випробувано в комісійному досліді та впроваджено у виробництво вакцину інактивовану проти вірусної діареї великої рогатої худоби (ТУ У 24.4-00497087-010:2006, реєстраційне посвідчення № 2511-04-0292-07).

2. Вірусна діарея великої рогатої худоби зареєстровано в усіх частинах світу. За даними МЕБ протягом 1996-2004 рр. цю хворобу встановлено у 110 країнах. Найбільш неблагополучною є ситуація щодо цього захворювання в країнах Європейського континенту, де реєструється 32 % випадків вірусної діареї в світі. За період спостереження (9 років) кількість країн, де застосовують вакцинопрофілактику вірусної діареї, зросла в 1,5 рази, загальна кількість вакцинованих тварин - у 126 разів.

3. При вивченні чутливості культур клітин НТ, ТРТ, КСТ, НВ до вірусу діареї встановлено їх різну чутливість до епізоотичних штамів ВК-1 і 25 та еталонного Oregon C 24 V. Найвищу інфекційність мав вірус діареї штам ВК-1, який накопичувався в культурі клітин КСТ у титрі (7,38±0,05) lg ТЦД50/см3 та ТТР у титрі 7,08±0,21 lg ТЦД50/см3.

4. Вірус діареї штам ВК-1 антигенно споріднений з епізоотичним штамом 25 (на 87 %) та з еталонним Oregon C24V (на 83 %). Антигенна відмінність між цими штамами складала 4,9 % та 4,8 % відповідно.

5. Доведено стимуляцію функціональної активності щитовидної залози тиреотропним гормоном гіпофізу у відповідь на щеплення тварин живим вірусом діареї, що свідчить про супресивну дію вірусу та відсутність супресивного впливу на імунокомпетентні клітини тварин після його інактивації.

6. Концентрація формальдегіду 0,1 % є оптимальною для інактивації вірусу діареї штаму ВК-1 за температури 37 °С протягом 24 годин. Застосування адюванту КЕ 10-01 у вакцині інактивованій проти вірусної діареї забезпечує найбільш виражені імуностимулюючі та пролонгуючі властивості, про що свідчить приріст на 4 log2 противірусних антитіл в організмі щеплених вакциною тварин та їх збереження в организмі тварин впродовж 6-ти місяців (термін спостереження). Оптимальне співвідношення антигену та адюванту в вакцині складає 60 та 40 %, відповідно.

7. Визначення титру вірусу та постановка реакції нейтралізації за мікрометодом скорочує витрати компонентів у 5 разів, а час на проведення дослідження у 8 разів. Доведено відсутність вірогідної різниці у результатах титрування вірусу та постановки реакції нейтралізації макро- та мікрометодами (Р > 0,05).

8. Вакцина інактивована проти вірусної діареї при щепленні телят і корів у дозі 5 см3 забезпечує високий рівень специфічного противірусного імунітету впродовж 6-ти місяців (термін спостереження). Після застосування вакцини антитіла до вірусу діареї накопичуються в молозиві на рівні 6,8 log2 у день отелення і поступово зникають до 21 доби в молоці. Своєчасне випоювання молозива новонародженим телятам сприяє їх захисту від вірусної діареї та формуванню групового імунітету у стаді.

9. Розроблена технологія виготовлення вакцини інактивованої проти вірусної діареї великої рогатої худоби дозволяє отримувати стерильний, нешкідливий та антигенно активний препарат. У разі дотримання стандартних умов зберігання вакцина залишається придатною до застосування протягом 12 місяців (термін спостереження) з моменту її виготовлення.

Пропозиції виробництву

“Методичні вказівки по постановці реакції нейтралізації мікрометодом для визначення антитіл до вірусу діареї-хвороби слизових великої рогатої худоби”, затверджені науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України (протокол № 1 від 12 грудня 2003 р.).

“Вакцина інактивована проти вірусної діареї великої рогатої худоби”: - ТУ У 24.4-00497087-010:2006 на “Вакцину інактивовану проти вірусної діареї великої рогатої худоби”, затверджені Головним державним інспектором ветеринарної медицини України 24 листопада 2006 року;

- реєстраційне посвідчення № 2511-04-0292-07, видане Державним департаментом ветеринарної медицини України 23 березня 2007 року;

- “Інструкція з виготовлення та контролю вакцини інактивованої проти вірусної діареї великої рогатої худоби”, розглянута методичною радою та затверджена директором ННЦ „ІЕКВМ” 20 січня 2005 року;

- “Настанова з застосування вакцини інактивованої проти вірусної діареї великої рогатої худоби”, затверджена Головним державним інспектором ветеринарної медицини України 24 листопада 2006 року.

1. Вивчення реактогенних та антигенних властивостей дослідних зразків інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби /В. I. Стеценко, О. В. Годовський, Л. I. Кучерявенко, Л. П. Тризна// Вет. медицина: Міжвід. темат. наук. зб.- Х., 2003.- Вип. 81.- С.343-350. (Дисертантом проведені всі експериментальні дослідження, обробка даних та частково їх узагальнення).

2. Годовский А. В. Оценка иммуногенной активности образцов инактивированной вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота с применением различных адьювантов / А. В. Годовський // Вет. медицина: Міжвід. темат. наук. зб. - Х., 2004. - Вип.83. - С.42-46.

3. Годовський О. В. Використання мікрометоду реакції нейтралізації для проведення моніторингу та визначення серопозитивності до вірусної діареї великої рогатої худоби / О. В. Годовський, М. В. Бабкін // Вет. медицина: Міжвід. темат. наук. зб.- Х., 2004.- Вип.84.- С.225-229. (Дисертантом проведені всі експериментальні дослідження, обробка даних та частково їх узагальнення).

4. Годовський О. В. Антигенна активність інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби при застосуванні на глибокотільних коровах/ О. В. Годовський // Вет. медицина: Міжвід. темат. наук. зб. - Х., 2005. - Вип. 85, т. I. - С.289-293.

5. Деклараційний патент на корисну модель № 6072 Україна МПК А61К39/00 Вакцина інактивована проти вірусної діареї великої рогатої худоби / Б. Т. Стегній, В. І. Стеценко, О. В. Годовський, М. В. Бабкін, Л. І. Кучерявенко, Р. О. Кучерявенко (Україна). - № 20040806878; заявл. 16.08.2004; опубл. 15.04.2005; Бюл. № 4. - 2 с.