Дослідження можливого впливу мутаційних змін Bcr–послідовності онкобілка Bcr/Abl на зміни структури цитоскелету. Розробка підходів для детекції нормального білка Bcr та комплексного підходу до діагностики та моніторінгу лейкемії (хронічної стадії).
При низкой оригинальности работы "Вивчення молекулярно-генетичних механізмів пухлинної прогресії при Ph"-позитивних лейкеміях та їх діагностика", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
На молекулярному рівні реципрокна транслокація t(9;22)(q34;q11) супроводжується утворенням двох гібридних генів - гена bcr/abl на Ph’ хромосомі (представленого на 5"-кінці ділянкою гена bcr, а на 3"-кінці - ділянкою гена abl ) та abl/bcr на хромосомі 9q [Gishizky, 1996]. Наявність зазначених доменів корелює із характером перебігу захворювання: якщо експресія р190 виявляється лише у хворих на ГЛЛ, то р210 переважно виявляється у хворих на ХМЛ [Gishizky, 1996; Butturini et al., 1996]. Фізіологічна роль DH та PH - доменів полягає у модулюванні внутрішньоклітинного розташування онкобілка Bcr/Abl, опосередковано, шляхом впливу на організацію актинового цитоскелету (DH-домен) [Chuang et al., 1995], або безпосередньо, завдяки звязуванню з мембранними фосфоліпідами (PH-домен) [Shaw et al., 1996]. Аналіз мутацій в DH та PH доменах та дослідження їхнього впливу на фізіологію клітини буде сприяти більш глибокому розумінню молекулярних механізмів пухлинної прогресії та переходу ХМЛ до бластної кризи. 2) Провести мутаційний аналіз Dbl-кодуючої ділянки гена bcr/abl у хворих на ГЛЛ та у хворих на стадії бластної кризи ХМЛ методом хімічного розщеплення ДНК-ДНК гетеродуплексів та провести секвенування зазначеної ділянки гена bcr/abl з метою уточнення мутантних локусів;Ампліфіковані фрагменти КДНК гена bcr/abl, що відповідали ділянці гомології до гена плекстрину (2744-3333 п. о.) та Dbl-гомологічній ділянці (2015-2597 п.о. відповідно до послідовності КДНК гена bcr/abl ) було клоновано за центрами впізнавання для ендонуклеаз рестрикції Eco RI та Eco RV, відповідно, у вектор для бактерійної експресії PET32b фірми Novagen (Німеччина). Очищення рекомбінантних білків здійснювали хроматографією на Ni-NTA агарозі фірми Qiagen (Німеччина) в присутності 2 М сечовини для білка DDBA3 або в нативних умовах для білка PDBA138 згідно з рекомендаціями виробника. Концентрація білка після хроматографічного очищення складала 0.5 мг/мл для білка DDBA3 із чистотою 90% та 0.25 мг/мл для білка PDBA138 із чистотою 95-98%. Коефіцієнт екстинкції білка DDBA3 при довжині хвилі 280 нм складав 42060 М-1 ґ см-1, білка PDBA138 - 41820 М-1 ґ см-1. Для аналізу звязку між особливостями організації актинового цитоскелету і можливими змінами первинної структури dbl - ділянки у складі гена bcr/abl був проведений порівняльний аналіз мутацій для ДНК хворих Ф., К. і клітинної лінії К562 методом ПДРФ та хімічного розщеплення ДНК-ДНК гетеродуплексів.Детектовано локуси нуклеотидних замін dbl-гомологічного району КДНК гена bcr/abl, виявлені зміни екстрапольовано на третинну структуру Dbl-гомологічного домена білка Bcr/Abl . Оптимізовано умови детекції онкобілка Bcr/Abl і нормального білка Bcr у здорових та хворих донорів методом Вестерн-блот аналізу. Телегеев Г.Д., Дубровская А.Н., Дыбков М.В. Телегеев Г.Д., Дубровская А.Н., Дыбков М.В. Телегеев Г.Д., Дубровская А.Н., Дыбков М.В.
План
Основний зміст
Вывод
1. Встановлено звязок між мутаційними змінами в Dbl-гомологічному домені білка Bcr/Abl та характером організації актинового цитоскелету.
2. Детектовано локуси нуклеотидних замін dbl-гомологічного району КДНК гена bcr/abl, виявлені зміни екстрапольовано на третинну структуру Dbl-гомологічного домена білка Bcr/Abl .
3. Розроблено схему клонування, експресії та очищення рекомбінантних DH та PH доменів гібридного онкобілка Bcr/Abl і отримані поліклональні антитіла проти них.
4. Оптимізовано умови детекції онкобілка Bcr/Abl і нормального білка Bcr у здорових та хворих донорів методом Вестерн-блот аналізу.
5. Виявлено існування негативного зворотнього звязку між рівнем експресії онкобілка Bcr/Abl і його нормального гомолога Bcr.
Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації
1. Телегеев Г.Д., Дубровская А.Н., Дыбков М.В. Роль Bcr/Abl в лейкемогенезе // Экспериментальная онкология. -1999. -T. 21, №3-4. -C. 182-194.
2. Телегеев Г.Д., Дубровская А.Н., Дыбков М.В. Мутации в гибридном bcr/abl гене как возможный фактор опухолевой прогрессии при ХМЛ // Біополімери і клітина. -2000. -T. 16, №6. -C. 482-486.
3. Телегеев Г.Д., Дубровская А.Н., Дыбков М.В. Мачило В.М., Гартовская И.Р. Детекция Ph’-хромосомы при помощи полимеразной цепной реакции // Гематологія і трансфузіологія. -2000. -T 1, №1. -C. 37-40.
4. Телегеєв Г.Д., Дибков М.В., Дубровська А.М., Малюта С.С. Делеція пятого екзона гена bcr/abl при гострому лімфобластному лейкозі з філадельфійською хромосомою // Біополімери і клітина. - 2001. - T. 17, №4. - C. 298-301.
5. Телегеев Г.Д., Дубровская А.Н., Дыбков М.В. Ингибитор тирозинкиназ STI571 в терапии Ph’-лейкозов // Гематологія і трансфузіологія. -2001. -T. 3, №1. - C. 14-21.
6. Дубровская А.Н., Телегеев Г.Д., Дыбков М.В., Волошаненко О.С., Швед В.В., Малюта С.С. Мутационный анализ и бактериальная экспрессия Dbl-гомологичного домена химерного белка Bcr/Abl // Біополімери і клітина. - 2002. - T. 18, №2. - C. 96-101.
7. M.V. Dybkov, G.D. Telegeev, A.N. Dubrovskaya, S.S. Maliuta. Deletion in dbl domain of bcr/abl gene in leukemia patients with Ph" chromosome // Experimental Oncology. - 2002. - Vol. 24, №2. - P. 153-154.
8. Телегеев Г.Д., Колийчук А.Н., Дыбков М.В., Третяк Н.М., Малюта С.С. Детекция филадельфийской хромосомы при помощи молекулярно-биологических методов // Материалы конференции "Состояние медицинской генетики на Украине". - Київ. - 1999. - C. 138-139.
9. Телегеев Г.Д., Колийчук А.Н., Дыбков М.В., Третяк Н.М., Малюта С.С. ПЦР-диагностика множественной миеломы с использованием аллельспецифических праймеров //. Матеріали конференції "Состояние медицинской генетики на Украине". - Київ. - 1999. - C. 139.
10. Telegeev G.D., Dybkov M.V., Dubrovskaya A.N., Maliuta S.S. A second mutation of bcr/abl oncogene as a possible factors of tumor progression // Abstr. second congress of oncologist of country of UIS. - Kyiv. - 2000. - P. 207.
11. Dubrovskaya A.N. Dbl domain mutations of the Bcr/Abl oncoprotein as a prerequisite for CML tumor progression // Abst. Conference for students, PHD students and young scientists. - Kyiv. -2001. - P. 137.
12. Волошаненко О.С., Дубровская А.Н., Телегеев Г.Д., Малюта С.С. Бактериальная экспрессия РН домена онкобелка Bcr/Abl и получение поликлональных антител для его иммунохимической детекции // Материалы 6-й Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". - T. 1. - Пущино (Российская Федерация). - 2002. - C. 230.
13. Волкова И.А., Дубровская А.Н., Телегеев Г.Д., Дыбков М.В. Клонирование и бактериальная экспрессия Dbl-гомологичного домена слитого BCR/ABL белка // Материалы 6-й Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". - T. 1. - Пущино (Российская Федерация). - 2002. - C. 227.
14. Telegeev G.D., Dybkov M.V., Dubrovska A.N., Maliuta S.S. Influence of Bcr/Abl fusion proteins on course of Ph" leukemias // Abstr. 4rd Parnas Conference Molecular mechanism of cell activation: biological signals and their target enzymes.-Wroclaw (Poland). - 2002. - P. 22.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
