Вивчення методом сайт-направленого мутагенезу елементів впізнавання тирозинової тРНК тирозил-тРНК синтетазою з вищих еукаріотів - Автореферат

Численні біохімічні та генетичні дослідження показують, що специфічність аміноацилювання повязана з наявністю в ТРНК та аміноацил-ТРНК синтетазах набору структурних елементів - детермінант впізнавання, які формують ряд строго визначених РНК-білкових контактів, забезпечуючи таким чином селекцію споріднених ТРНК і дискримінацію проти решти ТРНК. Зважаючи на вищезгадане, актуальним є дослідження ролі окремих структурних елементів тирозинової ТРНК та тирозил-ТРНК синтетази з печінки бика як детермінант відповідності в реакції аміноацилювання. Метою цієї роботи було вивчення із застосуванням методу сайт-направленого мутагенезу структурних елементів специфічного впізнавання тирозинової ТРНК тирозил-ТРНК синтетазою з печінки бика в реакції аміноацилювання. Використовуючи метод сайт-направленого мутагенезу вивчено роль окремих структурних елементів тирозинової ТРНК та тирозил-ТРНК синтетази печінки бика як детермінант відповідності в реакції аміноацилювання. Отримані в роботі результати стосовно ролі нуклеотидів першої пари акцепторного стебла, антикодонового триплету та варіабельної петлі тирозинової ТРНК і амінокислотного залишку лізин-147 тирозил-ТРНК синтетази печінки бика як детермінант відповідності в реакції аміноацилювання, а також впливу додаткового С-кінцевого домену тирозил-ТРНК синтетази бика на її ферментативну активність, можуть бути використані для подальшого детального вивчення структурно-функціональних механізмів регуляції дорибосомного етапу біосинтезу білка в клітинах вищих еукаріотів.Оскільки початок структурної частини штучного гена TPHKTYR бика: 5’-CCTTCGA… є несприятливим для транскрипції Т7 РНК-полімеразою (Milligan et al., 1987), на 5"-кінець структурної частини було введено додатковий гуанозин - G(-1). Для введення нуклеотидних замін у позиції 1 і 72 штучного гена TPHKTYR бика методом ПЛР як матрицю використовували плазміду PBY 1.3, що несе штучний ген TPHKTYR дикого типу. Для заміни цитозину на гуанозин у позиції 1 TPHKTYR використовували 5?-мутантний праймер: 5?-Gaattctaatacgactcactatagcttcgatagc-3?, комплементарний (-) ланцюгу штучного гена дикого типу в ділянці Т7 промотору і 5?-частини акцепторного стебла TPHKTYR, за винятком позицій-1 і 1. Для введення мутацій у позицію 72 використовували набір 3?-мутантних праймерів: 5?-ggatcctggt(g,a,t)cttccagccg-3?, комплементарних ( )-ланцюгу штучного гена дикого типу в 3"-кінцевій ділянці за винятком заміни цитозину в позиції праймера, що відповідає позиції 72 у гені дикого типу, на гуанозин, аденозин чи тимідин. При використанні 5"-мутантного праймера в парі з кожним із 3"-мутантних праймерів були отримані варіанти штучного гена з першою парою акцепторного стебла: G1:C72, G1:A72 та G1:U72.У дисертаційній роботі досліджено роль окремих структурних елементів тирозинової ТРНК та тирозил-ТРНК синтетази печінки бика в реакції аміноацілювання. Із застосуванням сайт-направленого мутагенезу отримано гени TPHKTYR бика з нуклеотидними замінами в першій парі акцепторного стебла, в антикодоновому триплеті та ділянці варіабельної петлі. Методами стаціонарної кінетики проведено дослідження впливу нуклеотидних замін на кінетичні параметри реакції аміноацилювання мутантних TPHKTYR-транскриптів рекомбінантною тирозил-ТРНК синтетазою печінки бика.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. У дисертаційній роботі досліджено роль окремих структурних елементів тирозинової ТРНК та тирозил-ТРНК синтетази печінки бика в реакції аміноацілювання. Сконструйовано та клоновано штучний ген тирозинової ТРНК печінки бика. Із застосуванням сайт-направленого мутагенезу отримано гени TPHKTYR бика з нуклеотидними замінами в першій парі акцепторного стебла, в антикодоновому триплеті та ділянці варіабельної петлі.

Методами стаціонарної кінетики проведено дослідження впливу нуклеотидних замін на кінетичні параметри реакції аміноацилювання мутантних TPHKTYR-транскриптів рекомбінантною тирозил-ТРНК синтетазою печінки бика.

2. Показано, що основною структурною детермінантою відповідності TPHKTYR-транскрипту в ділянці першої пари акцепторного стебла є нуклеотид в позиції 72, в той час як роль нуклеотиду в позиції 1 є значно меншою.

3. Визначено, що нуклеотиди 34 і 35 антикодону є важливими детермінантами відповідності TPHKTYR-транскрипту. Отримані результати свідчать про те, що в реакції аміноацилювання еукаріотичною тирозил-ТРНК синтетазою антикодоновий триплет TPHKTYR-транскрипту впізнається в межах 39 КДА каталітичного модуля ферменту.

4. Продемонстровано, що довжина варіабельної петлі TPHKTYR-транскрипту несуттєва для впізнавання еукаріотичною тирозил-ТРНК синтетазою в реакції аміноацилювання.

5. Встановлено, що додатковий С-кінцевий домен тирозил-ТРНК синтетази бика збільшує каталітичну ефективність реакції аміноацилювання TPHKTYR-транскрипту за рахунок підвищення спорідненості останнього до ферменту.

6. Показано, що амінокислотний залишок Lys147, який локалізований у сполучному пептиді нуклеотидзвязувального домену є критичним для активності тирозил-ТРНК синтетази бика в реакції аміноацилювання гомологічної TPHKTYR.

1. Найденов В.Г., Вудмаска М.И., Корнелюк А.И., Мацука Г.Х. Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-ТРНК синтетазы из печени быка // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т.16, №4. - С. 275-279.

2. Найденов В.Г., Вудмаска М.И., Мацука Г.Х. Кинетические параметры аминоацилирования TPHKTYR транскрипта тирозил-ТРНК синтетазой из печени быка // Біополімери і клітина. - 2001. - Т.17, №6. - С. 534-539.

3. Найденов В.Г., Вудмаска М.И., Мацука Г.Х. Роль нуклеотидов в позициях 1 и 72 акцепторного стебля TPHKTYR в аминоацилировании тирозил-ТРНК синтетазой печени быка // Біополімери і клітина. - 2002. - Т.18, №1. - C. 71-75.

4. Levanets O.V., Naidenov V.G.,Odynets K.A., Vudmaska M.I., Matsuka G.Kh., Wientjes F. J., Gassen H.G., Kornelyuk A.I. Cloning, seguensing and bacterial expression of bovine tyrosyl-TRNA synthetase // Abstracts of EMBO Workshop on Structure and Function of Aminoacyl synthetases. - Mittelwihr (France). - 1998. - Р.100.

5. Naidenov V.G., Vudmaska M.I., Matsuka G.Kh. The role of G72 for TRNATYR identity //Abstracts of Asilomar Conference on Aminoacyl-TRNA synthetases in Biology, Medicine and Evolution. - Pacific Grove (USA). - 2002. - P.109.

Размещено на .ru