Вивчення біологічно активних речовин Vitis vinifera та створення на їх основі лікарських засобів - Автореферат

Пошук рослин з достатньою сировинною базою, комплексне використання сировини з метою створення нових лікарських засобів пояснює інтерес до вивчення плодово-ягідних культур. Інтерес до вичавки винограду, як вторинного виду сировини, обумовлений рядом факторів, серед яких: до складу вичавки входить комплекс БАР, якісний склад і кількісний вміст яких, дозволяє розглядати її як джерело для виробництва лікарських засобів, біологічно активних добавок та косметичних засобів; потенційні обєми виноградної вичавки дозволяють класифікувати її як промислову сировину; зростаючі обєми виноградної вичавки, які щорічно утворюються при переробці виноградних ягід, можуть складати серйозну загрозу для довкілля і тому потребують розробки ефективних шляхів її утилізації. Наявність достатньої сировинної бази, вміст великої кількості різних груп БАР, що мають різноманітну фармакологічну дію і розробка на їх основі нових лікарських засобів є актуальною проблемою сучасної фармації. Метою роботи було вивчення різних груп БАР листя та вичавок винограду культурного сортів Ізабелла та Каберне-Совіньйон та визначення можливості створення лікарських засобів на їх основі. провести попередні фітохімічні дослідження якісного складу листя та вичавок винограду культурного сортів Ізабелла та Каберне-Совіньйон;Обєктами наших досліджень були вичавки винограду культурного двох сортів Каберне-Совіньйон та Ізабелла і листя винограду сорту Ізабелла. Вичавки винограду сорту Каберне-Совіньйон були надані Інститутом винограду і вина “Магарач” (м.Ялта). За допомогою якісних реакцій, ТШХ та ПХ в листі та вичавках винограду культурного сортів Ізабелла та Каберне-Совіньйон було виявлено амінокислоти, полісахариди, вільні цукри, дубильні речовини, гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, антоціани, стільбени, щавлева кислота. Методом колонкової адсобційної хроматографії, рехроматографії на поліаміді і силікагелі, препаративної хроматографії на папері та в тонкому шарі з листя та вичавок винограду культурного сортів Ізабелла та Каберне-Совіньйон було виділено та ідентифіковано 35 речовин: з них 2 похідні бензойної кислоти, 4 гідроксикоричні кислоти, 3 гідроксикумарини, 2 флавони, 4 флавоноли, 3 С-глікозиди флавонів, 2 глікозиди кемпферолу, 5 глікозидів кверцетину, 1 глікозид ізорамнетину, 1 флаван, 5 антоціанів, 1 стільбен, 2 органічні кислоти. Речовини 2.10, 2.11 є флавоновими агліконами - апігенін та лютеолін; речовини 2.12-2.15 є флавоноловими агліконами - кверцетин, кемпферол, мірицетин, ізорамнетин; речовини 2.16-2.18 є С-глікозидами флавонів - вітексин, сапонаретин, гомоорієнтин; речовини 2.19 та 2.20 є глікозидами кемпферолу - астрагалін, нікотифлорин; речовини 2.21-2.25 є глікозидами кверцетину - авікулярин, гіперозид, ізокверцитрин, кверцитрин, рутин; речовина 2.26 є глікозидом ізорамнетину - ізорамнетин-3-О-в-D-глюкопіранозид; речовина 2.27 є флаваном - таксифолін; речовини 2.28-2.32 є антоціанами - дельфінідин-3-О-глікозид, мальвідин-3-О-глікозид, ціанідин-3-О-глікозид, мальвідин-3,5-диглікозид, ціанідин-3,5-диглікозид про що свідчать якісні реакції, хроматографічна поведінка в різних системах розчинників, дані УФ-, ІЧ-, ПМР спектрів та результати хімічних перетворень.Вперше проведено комплексне вивчення біологічно активних речовин Vitis vinifera, сортів, що є промисловими в Україні. За допомогою якісних реакцій, хроматографічних методів аналізу, тривимірної скануючої спектрофлуоріметрії в листі та вичавках винограду культурного сортів Ізабелла та Каберне-Совіньйон виявлені полісахариди, вільні та звязані цукри, дубильні речовини, гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, антоціани, стільбени, щавлева кислота, хлорофіли та каротиноїди. З листя та вичавок винограду сорту Ізабелла та вичавок винограду сорту Каберне-Совіньйон виділено в індивідуальному стані 35 речовин. На основі фізико-хімічних властивостей вихідних речовин та продуктів їх хімічних перетворень, даних УФ-, ІЧ-, ПМР спектроскопії, порівнянні з вірогідними зразками встановлено їх структуру: похідні бензойної кислоти - галова та елагова кислоти; гідроксикоричні кислоти - кавова, хлорогенова, неохлорогенова, n-кумарова кислоти; гідроксикумарини - умбеліферон, скополетин, ескулетин; флавони - апігенін, лютеолін; флавоноли-кверцетин, кемпферол, мірицетин, ізорамнетин; С-глікозиди флавонів - вітексін, сапонаретин, гомоорієнтин; глікозиди кемпферолу - астрагалін, нікотифлорин; глікозиди кверцетину - авікулярин, гіперозид, ізокверцитрин, кверцитрин, рутин; глікозид ізорамнетину - ізорамнетин-3-О-в-D-глюкопіранозид; флаван - таксифолін; антоціани - дельфінідин-3-О-глікозид, мальвідин-3-О-глікозид, ціанідин-3-О-глікозид, мальвідин-3,5-диглікозид, ціанідин-3,5-диглікозид; стільбен - ресвератрол; органічні кислоти - щавлева та винна кислоти. Одержані фракції полісахаридів з листя та вичавок винограду: водорозчинні полісахариди, пектинові речовини, геміцелюлози А і Б; вперше методом хроматографії на папері вивчено їх мономерний склад.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. Вперше проведено комплексне вивчення біологічно активних речовин Vitis vinifera, сортів, що є промисловими в Україні.

2. За допомогою якісних реакцій, хроматографічних методів аналізу, тривимірної скануючої спектрофлуоріметрії в листі та вичавках винограду культурного сортів Ізабелла та Каберне-Совіньйон виявлені полісахариди, вільні та звязані цукри, дубильні речовини, гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, антоціани, стільбени, щавлева кислота, хлорофіли та каротиноїди.

3. З листя та вичавок винограду сорту Ізабелла та вичавок винограду сорту Каберне-Совіньйон виділено в індивідуальному стані 35 речовин. На основі фізико-хімічних властивостей вихідних речовин та продуктів їх хімічних перетворень, даних УФ-, ІЧ-, ПМР спектроскопії, порівнянні з вірогідними зразками встановлено їх структуру: похідні бензойної кислоти - галова та елагова кислоти; гідроксикоричні кислоти - кавова, хлорогенова, неохлорогенова, n-кумарова кислоти; гідроксикумарини - умбеліферон, скополетин, ескулетин; флавони - апігенін, лютеолін; флавоноли -кверцетин, кемпферол, мірицетин, ізорамнетин; С-глікозиди флавонів - вітексін, сапонаретин, гомоорієнтин; глікозиди кемпферолу - астрагалін, нікотифлорин; глікозиди кверцетину - авікулярин, гіперозид, ізокверцитрин, кверцитрин, рутин; глікозид ізорамнетину - ізорамнетин-3-О-в-D-глюкопіранозид; флаван - таксифолін; антоціани - дельфінідин-3-О-глікозид, мальвідин-3-О-глікозид, ціанідин-3-О-глікозид, мальвідин-3,5-диглікозид, ціанідин-3,5-диглікозид; стільбен - ресвератрол; органічні кислоти - щавлева та винна кислоти. З них елагова кислота, апігенін, ізорамнетин, нікотифлорин, ізорамнетин-3-О-в-D-глюкопіранозид, таксифолін виділені вперше.

4. Одержані фракції полісахаридів з листя та вичавок винограду: водорозчинні полісахариди, пектинові речовини, геміцелюлози А і Б; вперше методом хроматографії на папері вивчено їх мономерний склад.

5. Визначено кількісний вміст звязаних амінокислот, вміст макро- і мікроелементів, вільної і звязаної щавлевої кислоти. З речовин фенольної природи визначено кількісний вміст флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин (перманганатометричний та комплексонометричний метод), суми поліфенольних сполук у перерахунку на галову кислоту.

6. Вперше запропоновані оптимальні умови для максимального вилучення антоціанів з вичавок винограду культурного сортів Ізабелла та Каберне-Совіньйон та визначено їх кількісний вміст.

7. Отримані ліпофільні фракції та визначено в них кількісний вміст вільних жирних кислот, хлорофілів та каротиноїдів.

8. Розроблено спосіб одержання густого екстракту з листя винограду культурного сорту Ізабелла.

9. Проведено стандартизацію отриманого густого екстракту та визначена його гостра токсичність і гепатопротекторна активність. На спосіб одержання екстракту з листя винограду культурного отримано патент України на корисну модель № 15746.

10. Вперше проведені фармакологічні дослідження на здатність подрібнених вичавок винограду культурного сорту Каберне-Совіньйон впливати на імунні процеси.

11. Розроблені проекти АНД на “Листя винограду культурного сорту Ізабелла”, “Вичавки винограду культурного сорту Каберне-Совіньйон”, “Густий екстракт з листя винограду культурного сорту Ізабелла”.

1. Кузнєцова В.Ю., Кисличенко В.С. Вивчення ліпофільного складу червоноплодих сортів винограду культурного // Збірн. Наук. Праць співроб. КМАПО ім. П.Л. Шупіка. - 2003. - вип. 12, кн.2. - С. 784-788. (Особистий внесок - отримання експериментальних даних, узагальнення даних, написання статті).

2. Вплив екстракту з листя винограду на показники перекисного окислення ліпідів у мишей та щурів на фоні дії хлориду кадмію / Загайко А.Л., Вороніна Л.М., Набока О.І., Кисличенко В.С., Кузнєцова В.Ю. // Клінічна фармація - 2003. - Т. 7, № 1. - С. 45-49. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних дослідженнь та написанні статті).

3. Кузнєцова В.Ю., Кисличенко В.С. Поліфенольні сполуки винограду культурного // Медична хімія. - 2004. - Т. 6, № 1. - С. 54-63. (Особистий внесок - виконання експерименту, узагальнення даних, написання статті).

4. Вивчення антиокиснювальної активності фенольних комплексів винограду культурного in vitro / Вороніна Л.М., Файзуллін О.В., Кузнєцова В.Ю., Загайко А.Л., Стрельченко К.В. // Медична хімія. - 2005. - Т. 7, № 2. - С. 89-91. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних дослідженнь та написанні статті).

5. Кузнєцова В.Ю., Кисличенко В.С. Вибір оптимальних умов екстракції антоціанів з вичавок винограду культурного // Медична хімія. - 2005. - Т. 7, № 4. - С. 56-57. (Особистий внесок - отримання експериментальних даних, узагальнення даних, написання статті).

6. Кузнєцова В.Ю., Кисличенко В.С. Вивчення полісахаридного та елементного складу вичавок винограду культурного // Фармацевтичний журнал - 2005. - № 3. - С. 95-97. (Особистий внесок - отримання експериментальних даних, узагальнення даних, написання статті).

7. Кузнєцова В.Ю., Кисличенко В.С. Амінокислотний склад вичавок винограду культурного // Фітотерапія. Часопис. - 2005. - № 1. - С. 55-57. (Особистий внесок - отримання експериментальних даних, узагальнення даних, написання статті).

8. Липиды и липофильные компоненты некоторых лекарственных растений / Кисличенко В.С., Новосел Е.Н., Кузнецова В.Ю., Вельма В.В., Болоховец А.С. // Химия природных соединений. - № 2. - 2006. - С. 182-183. (Особистий внесок - узагальнення даних, написання статті).

9. Патент України на винахід № 59681А А 61К35/78. Спосіб одержання поліфенольного комплексу "Флавітин" з протизапальною, анальгетичною, противиразковою та антиоксидантною активністю / Кисличенко В.Ю., Адель Ахмад Халіль Абуюсеф (JO), Кузнєцова В.Ю., Вороніна Л.М., Король В.В., Набока О.І. Заявл. 15.11.2002; Опубл. 15.09.2003 Бюл. № 9. (Особистий внесок - участь у патентному пошуку, проведення досліджень, узагальнення результатів, участь у підготовці матеріалів патенту).

10. Патент України на корисну модель № 15745 А61К 36/00. Спосіб одержання засобу з гепатопротекторною активністю / Кузнєцова В.Ю., Кисличенко В.С., Яремчук О.О., Башура О.Г., Файзуллін О.В. Заявл. 16.01.2006; Опубл. 17.07.2006 Бюл. № 7. (Особистий внесок - участь у патентному пошуку, проведення досліджень, узагальнення результатів, участь у оформленні матеріалів патенту).

11. Выделение биологически активных комплексов из лекарственного растительного сырья и изучение их связи "структура - биологическая активность" / Кисличенко В.С., Ковалев В.Н., Комисаренко А.Н., Дроговоз С.М., Новосел Е.Н., Кузнецова В.Ю., Борисенко Е.И. // Связь "структура - свойства" биологически активных веществ: Материалы научно-практического семинара (20-22 мая, 2002 г.). - Гурзуф, 2002. - С.10-14.

12. Кузнєцова В.Ю., Кисличенко В.С. Вивчення якісного складу генеративних органів винограду культурного сорту "Ізабелла" // Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія: Тези доповідей III Міжнародної науково-практичної конференції (21-23 травн., 2003 р.). - Х., 2003. - С. 174.

13. Распределение флавоноидов в органах и тканях крыс после введения суммарного комплекса из листьев винограда / Воронина Л.Н., Загайко А.Л., Набока О.И., Чумак Е.И., Кисличенко В.С., Кузнецова В.Ю. // Биологически активные природные соединения винограда: применение в медицине продуктов с высоким содержанием полифенолов винограда: Материалы научной конференции (19 февр., 2003 г.). - Симферополь, 2003. - С. 194-197.

14. Кисличенко В.С., Кузнєцова В.Ю. Перспективи використання винограду культурного в фітотерапії // Фітотерапія в реабілітації хворих: Збірник тез науково-практичної конференції. - К., 2003. - С. 92-93.

15. Кузнєцова В.Ю., Кисличенко В.С. Перспективи використання вичавок винограду для створення нових лікарських засобів // Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії: Матеріали Всеукраїнського науково-практичного семінару (26 лист., 2004 р.). - Х., 2004. - С. 248-251.

16. Кузнєцова В.Ю., Кисличенко В.С. Вичавка винограду культурного як перспективне джерело отримання біологічно активних добавок // Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок: Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю. - Тернопіль, 2004. - С. 113-115.

17. Получение и изучение пектинов из различных видов ЛРС / Кисличенко В. С., Новосел Е.Н., Кузнецова В.Ю., Болоховец А.С. // Актуальные проблемы образования, науки и производства в фармации: Материалы научно-практической конференции (18-19 окт., 2005 г.). - Ташкент, 2005. - С. 108-109.

18. Кузнєцова В.Ю., Кисличенко В. С. Вивчення кількісного вмісту щавлевої кислоти в листі та вичавках винограду культурного // Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України: Матеріали VI Національного з‘їзду фармацевтів України (28-30 вер., 2005 р.). - Х., 2005. - С. 739.

19. Кузнєцова В.Ю., Бурд Н.Б., Кисличенко В. С. Використання тривимірної спектроскопії для якісного аналізу ліпофільних екстрактів // Методи хімічного аналізу: Тези доповідей Другого міжнародного симпозіуму (14-17 черв., 2005 р.). - Ужгород, 2005. - С. 24-25.

20. Kislichenko V. S., Kuznetsova V.Yu., Juravel I.A. The phytochemical studies of grape leaves // 6th International Symposium on the chemistry of natural compounds (SCNC) (28-29 Jun. 2005). - Ankara-Turkey, 2005. - P. 54.

АНТАЦІЇ

Кузнєцова В.Ю. “Вивчення біологічно активних речовин Vitis vinifera та створення на їх основі лікарських засобів”. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. Національний фармацевтичний університет, Харків, 2006.

Дисертація присвячена вивченню біологічно активних речовин листя та вичавок винограду культурного сортів Ізабелла та Каберне-Совіньйон. Проведені системні фітохімічні та фармакологічні дослідження винограду культурного. Досліджено якісний склад та кількісний вміст різних груп біологічно активних речовин у листі та вичавках винограду сортів Ізабелла та Каберне-Совіньйон.

З листя та вичавок винограду виділено в індивідуальному стані та встановлено структуру 35 речовин: 2 похідних бензойної кислоти, 4 гідроксикоричних кислоти, 3 похідних кумарину, 18 флавоноїдів, 5 антоціанів, 1 стільбену, 2 органічних кислот.

Розроблено спосіб отримання густого екстракту з листя винограду культурного сорту Ізабелла, для якого визначена гостра токсичність та гепатопротекторна активність. Для подрібнених вичавок винограду сорту Каберне-Совіньйон проведені фармакологічні дослідження на здатність їх впливати на імунні процеси.

Розроблені проекти АНД на лікарську рослинну сировину “Листя винограду культурного сорту Ізабелла”, “Вичавки винограду культурного сорту Каберне-Совіньйон” та “Густий екстракт з листя винограду культурного сорту Ізабелла”

Ключові слова: виноград культурний (Vitis vinifera), біологічно активні речовини, вичавки, екстракт, гепатопротекторна та імуностимулююча активність.

Кузнецова В.Ю. “Изучение биологически активных веществ Vitis vinifera и создание на их основе лекарственных средств ”. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2006.

Диссертация посвящена изучению биологически активных веществ листьев и выжимок винограда культурного сортов Изабелла и Каберне-Совиньйон. Виноградная выжимка является отходом производства винодельческих предприятий, а листья винограда остаются после обрезания виноградной лозы. Достаточная сырьевая база, наличие различных групп биологически активных веществ, стали фундаментом дальнейших исследований.

В листьях и выжимках винограда культурного сортов Изабелла и Каберне-Совиньйон качественными реакциями, хроматографическими методами исследований, трехмерной флуоресцентной спектроскопией обнаружены свободные сахара, полисахариды, аминокислоты, флавоноиды, гидроксикоричные кислоты, антоцианы, стильбены, дубильные вещества, хлорофиллы, каротиноиды, свободные жирные кислоты.

Из листьев и выжимок винограда двух сортов выделено в индивидуальном состоянии и установлена структура 35 веществ: 2 производных бензойной кислоты, 4 гидроксикоричных, 3 производных, 18 флавоноидов, 5 антоцианов, 1 стильбена, 2 органических кислот. Эллаговая кислота, апигенин, изорамнетин, никотифлорин, изорамнетин-3-О-в-D-глюкопиранозид, таксифолин выделены впервые из исследуемых объектов.

Из листьев и выжимок винограда получены фракции водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ, гемицеллюлоз и методом бумажной хроматографии в сравнении с достоверными образцами моносахаридов установлен их мономерный состав. Фракции водорастворимых полисахаридов содержали глюкозу, ксилозу, галактозу и арабинозу; фракции пектиновых веществ - глюкозу, ксилозу, арабинозу, а также галактуроновую и глюкуроновую кислоты; фракции гемицеллюлоз - глюкозу, ксилозу, галактозу, арабинозу и рамнозу.

Методом атомноабсорбционной спектроскопии установлено количественное содержание макро- и микроэлементов. Листья винограда культурного сорта Изабелла в значительном количестве накапливают фосфор, магний и марганец. Выжимки винограда изучаемых сортов не отличаются высоким содержанием макро- и микроэлементов в связи с тем, что в основном они остаются в соке винограда.

Впервые в листьях и выжимках винограда культурного обоих изучаемых сортов определено количественное содержание щавелевой кислоты, как в свободном состоянии, так и в виде растворимых и нерастворимых солей.

Из соединений фенольного комплекса было определено количественное содержание дубильных веществ (метод Левенталя и комплексонометрический метод), гидроксикоричных кислот (в пересчете на хлорогеновую кислоту), флавоноидов (в пересчете на рутин), суммы полифенольных соединений (в пересчете на галловую кислоту), антоцианов (в пересчете на цианидина хлорид). Для определения условий, которые дают возможность извлечь максимальное количество антоцианов, был проведен комплекс исследований. Установлено влияние природы экстрагентов, процентного содержания соляной кислоты в них и температурного режима. Навеска сырья, степень ее измельчения и время экстракции были одинаковыми. Экстрагентом, который максимально извлекал антоцианы, был определен 50 % этанол с добавлением 1 % соляной кислоты.

Получены липофильные фракции, изучен их жирнокислотный состав и количественное содержание хлорофиллов и каротиноидов. Во всех исследуемых объектах преобладают ненасыщенные жирные кислоты: олеиновая, линолевая и линоленовая. В липофильной фракции из выжимок винограда культурного сорта Каберне-Совиньйон суммарное содержание ненасыщенных жирных кислот составляет 88,17%, в липофильной фракции из листьев винограда культурного сорта Изабелла 72,33%.

Разработан способ получения густого экстракта из листьев винограда культурного сорта Изабелла с учетом степени измельченности сырья, природы экстрагента, соотношения сырья и экстрагента, времени и кратности экстракции. В результате проведенных фармакологических исследований установлено, что полученный экстракт является нетоксичным и проявляет гепатопротекторную активность.

Для измельченных выжимок винограда культурного сорта Каберне-Совиньйон впервые проведены предварительные фармакологические исследования по изучению их иммуностимулирующих свойств и показана перспективность дальнейших углубленных исследований.

Впервые проведено анатомическое изучение листьев винограда культурного сорта Изабелла и определены их диагностические признаки.

По результатам исследований разработано 3 проекта АНД на “Листья винограда культурного сорта Изабелла”, “Выжимки винограда культурного сорта Каберне-Совиньйон”, “Густой экстракт из листьев винограда культурного сорта Изабелла”.

Ключевые слова: виноград культурный (Vitis vinifera), биологически активные вещества, выжимки, экстракт, гепатопротекторная, иммуностимулирующая активность.

Kuznetsova V.Yu. “The study of Vitis vinifera biologically active substances and creation of drugs on their basis”- Manuscript

The thesis to obtain a degree of the candidate of pharmaceutical science, speciality 15.00.02- pharmaceutical chemistry and pharmacognosy, National Pharmaceutical University, Kharkiv, 2006.

The thesis is devoted to the study of biologically active substances in Vitis vinifera leaves and husks, Isabella and Kaberne-Sovinion species. The grape was systematically, phytochemically and pharmacologically researched. The quantitative composition and qualitative content of different groups of biologically active substances in Vitis vinifera leaves and husks, Isabella and Kaberne -Sovinion species, were studied.

Thirty five substances including two derivatives of benzoic acid, four hydroxicinnamine acids, three derivatives of coumarins, eighteen flavonoids, five antocyans, one stilbene and two organic acids were isolated and their structure was determined.

The method of obtaining of Vitis vinifera leaves thick extract, species Isabella was developed, its acute toxicity and hepatoprotective activity were determined.

Preliminary pharmacological research was made to determine their ability to influence the immune system.

The following draft sets of AND for the medicinal herb raw materials: “The leaves of the Isabella grapes”, “The husks of the Kaberne-Sovinion grapes” and “Thick Extracts made from the Isabella grapes leaves”.

Key words: The grapes (Vitis vinifera), biologically active substances, husks, extract, hepatoprotective and immunostimulative activity.

?aciauaii ia .ru