Виділення та зберігання біологічно активної низькомолекулярної фракції (до 5 КДА) з кордової крові за допомогою низьких температур - Автореферат

Беручи до уваги наявність в кордовій крові комплексу ростових факторів, цитокінів та інших біологічно активних сполук, які забезпечують швидкий ріст та диференціювання тканин, було припущено, що низькомолекулярна фракція кордової крові може мати стимулюючий вплив на клітинний метаболізм і, завдяки цьому, терапевтичну дію на перебіг репаративних процесів при травматичних або виразкових ушкодженнях сполучної тканини у модельних системах. Отже, отримання та збереження на основі кріотехнологій низькомолекулярних компонентів кордової крові забезпечить подальший прогрес в дослідженні та розробці препаратів природного походження. Метою дисертаційної роботи було визначити метод отримання, умови тривалого зберігання та біологічну активність низькомолекулярної фракції (до 5 КДА) із підданої кріодеструкції кордової крові великої рогатої худоби. Дослідити вплив фракції до 5 КДА із підданої кріодеструкції кордової крові на перебіг репаративних процесів у слизовій оболонці шлунку (СОШ) на моделі субхронічної виразки шлунку у щурів, використовуючи морфологічні та біохімічні методи. Методи дослідження: кріобіологічні, біохімічні, морфологічні, клініко-лабораторні та методи математичної статистики: ліофілізація; моделювання субхронічної виразки шлунку у щурів; оцінка ступеню виразкового ушкодження СОШ; гістологічне і гістохімічне дослідження стану СОШ з використанням методів світлової та лазерної скануючої мікроскопії; для виділення фракції до 5 КДА застосовували метод кріодеструкції та ультрафільтрації; спектр низькомолекулярних компонентів у фракції крові до 5 КДА визначали методом гель-проникної хроматографії; кількість лейкоцитів і еритроцитів оцінювали за загальноприйнятими клінічними методами; для вивчення біохімічних показників крові та вмісту загального гемоглобіну використовували спектрофотометричний метод.Спектр низькомолекулярних речовин, які містяться у фракції до 5 КДА кордової крові, крові молочних телят, корів і в препараті порівняння Актовегіні оцінювали за допомогою гель-проникної хроматографії на колонці (1,6 х 40 см), яка була заповнена полівініловим гелем Toyopeas 1HW-40 Fine (Toyo Soda, Japan), що дозволяє розділити молекули у діапазоні молекулярних мас від 0,1 до 10 КДА (Белоус А.М. и др., 1997). Іншим тваринам після створення моделі субхронічної виразки шлунку протягом 12 діб внутрішньомязово вводили: Групі 2 - фізіологічний розчин (контроль); Показниками важкості виразкового ураження при макроскопічному вивченні були середня площа виразок в групі, виражена в балах; відсоток тварин з виразками в групі, які дозволили розрахувати інтегральний показник противиразкової активності - виразковий індекс (ВІ), а на його основі - противиразкову активність (ПА, %). Середню площу виразкового ушкодження оцінювали за допомогою системи балів (Стефанова О.В., 2001), яка дозволяє врахувати якісно і кількісно всі види деструкції СОШ, де 0 балів - відсутність виразкових дефектів, 1 бал - наявність набряку, крововиливів, 1-3 невеликих виразок, 2 бали - більш 3 невеликих виразок чи однієї великої, 3 бали - виразка значних розмірів (діаметром до 4 мм). На 12 добу експерименту в області малої кривизни шлунку спостерігалися крововиливи, набряк, гіперемія середнього ступеню, порушення складчастості шлунку; наявність звиразкувань було знайдено у 100 % тварин, середня площа яких була 1,8 ± 0,15 балів, а виразковий індекс складав 1,8 (табл.У дисертаційній роботі представлено теоретичне та експериментальне узагальнення наукової проблеми, яка стосується використання кріотехнологій для отримання і зберігання низькомолекулярної біологічно активної фракції із кордової крові тварин, а також доцільності її використання для стимуляції репаративних процесів в слизовій оболонці шлунку після субхронічного виразкового ураження. Встановлено, що застосування кріодеструкції кордової крові з використанням одноразового циклу повільного заморожування-відтавання на першому етапі технологічного процесу та ультрафільтрації на другому дозволяє екстрагувати з даної природної сировини низькомолекулярну фракцію (до 5 КДА), біологічна активність якої перевищує біологічну активність препарату порівняння актовегіну. Використання ФКК сприяє достовірному зниженню площі виразкового ураження, яке корелює з відновленням мікроциркуляції, товщини та структури залозистого шару на фоні зниження рівня лейкоцитарної інфільтрації ушкоджених тканин, стимуляцією синтезу глікозаміногліканів, що веде до скорочення строків відновлення слизової оболонки шлунку і в більш ранні терміни у порівнянні з референс-препаратом актовегіном. Повнота і швидкість відновлення ушкодженої слизової оболонки шлунку залежить від стадії онтогенезу, на якій отримували низькомолекулярні фракції із крові тварин, і знижуються в ряду: фракція із кордової крові > фракція із крові молочних телят > фракція із крові дорослих корів (остання не має противиразкової дії).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У дисертаційній роботі представлено теоретичне та експериментальне узагальнення наукової проблеми, яка стосується використання кріотехнологій для отримання і зберігання низькомолекулярної біологічно активної фракції із кордової крові тварин, а також доцільності її використання для стимуляції репаративних процесів в слизовій оболонці шлунку після субхронічного виразкового ураження.

1. Встановлено, що застосування кріодеструкції кордової крові з використанням одноразового циклу повільного заморожування-відтавання на першому етапі технологічного процесу та ультрафільтрації на другому дозволяє екстрагувати з даної природної сировини низькомолекулярну фракцію (до 5 КДА), біологічна активність якої перевищує біологічну активність препарату порівняння актовегіну.

2. Встановлено, що фракція до 5 КДА, отримана із підданої кріодеструкції кордової крові, володіє противиразковою дією на моделі субхронічної виразки шлунку. Використання ФКК сприяє достовірному зниженню площі виразкового ураження, яке корелює з відновленням мікроциркуляції, товщини та структури залозистого шару на фоні зниження рівня лейкоцитарної інфільтрації ушкоджених тканин, стимуляцією синтезу глікозаміногліканів, що веде до скорочення строків відновлення слизової оболонки шлунку і в більш ранні терміни у порівнянні з референс-препаратом актовегіном.

3. Повнота і швидкість відновлення ушкодженої слизової оболонки шлунку залежить від стадії онтогенезу, на якій отримували низькомолекулярні фракції із крові тварин, і знижуються в ряду: фракція із кордової крові > фракція із крові молочних телят > фракція із крові дорослих корів (остання не має противиразкової дії). Встановлено, що спектр компонентів (до 5 КДА) ФКК якісно і кількісно відрізняється від спектру компонентів актовегіну, фракції із крові телят і корів.

4. Введення ФКК тваринам з виразкою сприяє нормалізації вмісту ТБК-активних продуктів та активності лужної фосфатази в периферичній крові, що свідчить про протизапалювальну дію фракції кордової крові.

5. Застосування ФКК у тварин з виразковим ураженням шлунку призводить до нормалізації таких клінічних показників периферичної крові, як рівень гемоглобіну, кількість еритроцитів та лейкоцитів.

6. Проведені дослідження показали, що ліофілізація та заморожування до -80°С нативної фракції кордової крові не знижує її противиразкової активності. Виявлена доцільність зберігання фракції в ліофілізованому стані через практично повну схоронність її біологічних властивостей протягом 1 року. Після введення ліофілізованої фракції кордової крові даного терміну зберігання спостерігалося скоріше зниження площі виразкового ураження, нормалізація вмісту продуктів ПОЛ і активності лужної фосфатази в периферичній крові щурів у порівнянні з введенням фракції, яка зберігалася при -80°С. Зберігання фракції в замороженому стані при -80°С можливо протягом 6 місяців, оскільки зберігання протягом 1 року знижує ії біологічну активність.

1.Гулевский А.К. Перспективы применения низкомолекулярной фракции кордовой крови в лечении язвенной болезни желудка / А.К. Гулевский, Е.С. Абакумова // Трансплантологія. - Т. 9, № 1. - 2007. - С.63 - 65.

2.Эффект стимуляции репаративных процессов под влиянием фракции до 5 КДА из пуповинно-плацентарной крови крупного рогатого скота / А.К. Гулевский, В.И. Грищенко, Н.Н. Моисеева, Е.С. Абакумова, А.Ю. Никольченко, И.И. Щенявский, О.Л. Долгих // Доповіді Національної Академії Наук України. - № 2. - 2008. - С. 157 - 160.

3.Влияние фракции кордовой крови (до 5 КДА) крупного рогатого скота на биохимические показатели крови при экспериментальной субхронической язве желудка у крыс / А.К. Гулевский, Е.С. Абакумова, Н.Н. Моисеева, О.Л. Долгих // Український біохімічний журнал. - 2008. - Т. 80, № 2. - С. 120 - 126.

4.Исследование биологической активности фракции до 5 КДА из криогемолизата крови крупного рогатого скота / А.К. Гулевский, Н.Н. Моисеева, Е.С. Абакумова, А.Ю. Никольченко, И.И. Щенявский, О.Л. Горина, А.В. Трифонова, Е.Г. Иванов // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т. 18, № 4. - С. 531-534.

5.Гулевський О.К. Вплив низькотемпературного зберігання та ліофілізації на біологічну активність фракції до 5 КДА кордової крові корів / О.К. Гулевський, О.С. Абакумова // Бюл. «Ветеринарна біотехнологія». - 2009. - № 15. - С. 79-83.

6.Гулевський О.К. Вивчення противиразкової активності низькомолекулярної фракції (до 5 КДА) крові великої рогатої худоби в залежності від стадії онтогенезу / О.К. Гулевський, О.С. Абакумова, Н.М. Моісєєва // Клінічна фармація. - 2009. - Т. 13, № 2. - С. 54-58.

7.Гулевський О.К. Вплив низькомолекулярної фракції (до 5 КДА) кордової крові на морфологічні показники слизової оболонки шлунку щурів при експериментальній субхронічній виразці / О.К. Гулевський, О.С. Абакумова // Вісник проблем біології і медицини. - 2009. - Вип. 2. - С.158 - 163.

8.Изучение язвозаживляющего действия низкомолекулярной фракции (меньше 5 КДА), выделенной из крови молочных телят, на модели хронической язвы желудка у крыс / А.К. Гулевский, Е.С. Абакумова, Н.Н. Моисеева, О.Л. Долгих // Проблемы криобиологии. - 2006.- Т. 16, № 4. - С. 438.

9.Изучение противоязвенного действия фракций до 5 КДА крови молочных телят и кордовой крови на модели хронической язвы желудка у крыс / А.К. Гулевский, Е.С. Абакумова, Н.Н. Моисеева, О.Л. Долгих // I Міжнародна конференція молодих вчених [“Біологія: від молекули до біосфери”]: Тези доп. - Харків, 2006. - С. 59.

10.Противиразкова дія ліофілізованої фракції до 5 КДА кордової крові / О.К. Гулевський, О.С. Абакумова, Н.М. Моісєєва, О.Л. Долгіх // Збірник тез III Міжнародної наукової конференції молодих вчених [“Молодь та поступ в біології”]. - Львів, 2007. - С.463 - 464.

11.Woundhealing and antiulcer activity of lactescent calf, cow and cord blood fractions less than 5 KDA / A.K. Gulevsky, Ye.S. Abakumova, N.N. Moiseeva, O.L. Dolgich // Book of abstract of the young scientists" international scientific conference [«Modern problems of microbiology and biotechnology»]. - Odessa, 2007. - P.134.

12.Гулевский А.К. Противиразкова дія фракції до 5 КДА кордової крові / А.К. Гулевский, Е.С. Абакумова // Український біохімічний журнал. - Т. 79, №4. - 2007. - С. 115.

13.Абакумова Е.С. Противоязвенная активность фракции до 5 КДА, полученной из криогемолизата кордовой крови, на модели субхронической язвы желудка у крыс / Е.С. Абакумова, Н.Н. Моисеева // Проблемы криобиологии. - Т. 17, № 2. - 2007. - С. 194.

14.Биологическая активность фракции до 5 КДА кордовой крови / А.К. Гулевский, Н.Н. Моисеева, А.Ю. Никольченко, И.И. Щенявский, Е.С. Абакумова // XIV Российский Национальный конгресс [«Человек и лекарство»]: Сб. Материалов конгресса. - Москва, 2007. - С. 814.

15.Гулевский А.К. Изучение свойств биологически активных веществ низкомолекулярных фракций до 5 КДА из крови крупного рогатого скота / А.К. Гулевский, Н.Н. Моисеева, А.Ю. Никольченко, И.И. Щенявский, Е.С. Абакумова, О.Л. Горина, Е.Г. Иванов // Научно-практическая конференция [«Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения»]: Тезисы докладов. - Новый Свет, 2009. - С. 291.