Удосконалення ветеринарно-санітарної експертизи і санітарної оцінки сирого незбираного молока, отриманого від хворих на лейкоз корів. Оцінка біологічного ризику розвитку інфекційного процесу лейкозу у лабораторних тварин при згодовуванні їм молока.
При низкой оригинальности работы "Ветеринарно-санітарна оцінка молока при лейкозі великої рогатої худоби", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Харчові продукти, у тому числі молоко, являють собою потенційне джерело різних патогенів, здатних викликати хвороби та завдавати шкоди споживачу. До таких хвороб належить і лейкоз - одна з найбільш актуальних проблем патології людей і тварин. Отже, проблема ветеринарно-санітарної експертизи молока залишається суперечливою і не до кінця вирішеною. Дисертаційна робота є частиною роботи науково-дослідної теми кафедри ветеринарно-санітарної експертизи Національного університету біоресурсів і природокористування України "Розробити правила ветеринарно-санітарної експертизи молока та мяса при лейкозі великої рогатої худоби" (номер державної реєстрації 0106U003310). розробити правила ветеринарно-санітарної експертизи молока при лейкозі великої рогатої худоби. лейкоз молоко ветеринарна експертизаДослідження проводилися протягом 2006-2008 років у науковій лабораторії кафедри ветеринарно-санітарної експертизи ННІ ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції тваринництва НУБІП України, дослідних господарствах Київської, Хмельницької та Черкаської областей, лабораторії Золотоніського маслоробного комбінату Золотоніського району Черкаської області, Київській міській державній лабораторії ветеринарної медицини, Українській лабораторії якості і безпеки продукції АПК, лабораторії ветеринарно-санітарної експертизи ІВМ УААН, лабораторії "Група хроматографії" Інституту біохімії ім. Матеріалом для дослідження слугували: корови української чорно-рябої молочної породи різної лактації, молоко та кров, отримані від позитивних та здорових негативних за РІД та ПЛР тварин. Для виконання роботи використано такі методи: гематологічні - за загальноприйнятими методиками: кількість лейкоцитів визначали в камері Горяєва; морфологічний аналіз лейкоцитів - у мазках крові, зафарбованих за Романовським-Гімза; ПЛР-діагностика - методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі із використанням флуоресцентних зондів та діагностичного набору "Лейко-ПЛР"; показники безпечності та якості молока визначали згідно з вимогами чинного ДСТУ 3662-97.При проведенні дворазових, з інтервалом у 30 діб, паралельних досліджень сироваток крові щодо виявлення в них специфічних антитіл ВЛ ВРХ у РІД та наявність специфічних фрагментів ДНК ВЛ ВРХ за ПЛР у реальному часі, поставлений за РІД діагноз не підтвердився у 18 тварин - серед них проби від 9 тварин дали негативну реакцію у РІД та ПЛР. Густина молока в 1-й дослідній групі як у РІД - та ПЛР-позитивних, так і у здорових тварин, практично знаходилася на одному рівні, але кислотність була значно вищою в молоці, отриманому від РІД - та ПЛР-позитивних корів. Масова частка білка в молоці, отриманому від РІД - та ПЛР-позитивних корів, була нижчою (на 16,8%), ніж у молоці, отриманому від здорових тварин. Молоко, відібране від тварин 2-ї дослідної групи, практично не мало відмінностей за кислотністю і густиною порівняно з контролем, проте масова частка жиру в молоці, отриманому від РІД-позитивних тварин, була нижчою, ніж у контролі (Р<0,01). У першій дослідній групі РІД - та ПЛР-позитивних корів, порівняно зі здоровими, загальна кількість мікроорганізмів у молоці перевищувала контроль у 2,2 раза, в другій - у 1,8, а в третій - у 2,5 раза.Вивчено епізоотичне значення та проведено аналіз ризиків під час згодовування такого молока. Концептуальна система факторів сукупності ризику розвитку лейкозу великої рогатої худоби відстежує ендогенний, повязаний з особливостями організму (порода, спадковість, вік тварин), та екзогенний (екологічний, технологічний, біологічний) вплив на сприйнятливих тварин, що може бути використане з метою практичного застосування показників ризику при плануванні оздоровчих заходів та контролю отримання безпечної продукції належної якості. Молоко, отримане від РІД - та ПЛР-позитивних корів залежно від року лактації має різні закономірності щодо якісних фізико-хімічних показників, які нижчі порівняно з молоком, отриманим від здорових корів. Молоко, отримане від РІД - та ПЛР-позитивних корів, мало значне бактеріальне обсіменіння (в 1,8-2,6 раза вище за дані контролю). Вміст макроелементів у молоці дослідних РІД - та ПЛР-позитивних корів знижувався (натрій - на 16%, калій - на 25, кальцій - на 18%), а мікроелементів - підвищувався (міді - на 19%, цинку - 44%).
План
Основний зміст роботи матеріал і методи досліджень
Вывод
Системний еколого-епізоотологічний аналіз спільності ризику поширення лейкозу в Україні. Лейкоз великої рогатої худоби характеризується значним і нерівномірним поширенням в Україні. Порівнюючи напруженість епізоотичної ситуації з лейкозу великої рогатої худоби у 2008 році в окремих регіонах України, слід зазначити, що найнеблагополучнішими є Київська, Харківська, Донецька області та АР Крим. На початок 2008 року в Україні зареєстровано 207 неблагополучних пунктів, виявлено за 12 місяців - 52, оздоровлено - 179. Благополучні щодо лейкозу 14 областей, серед яких: Закарпатська, Івано-Франківська, Львівська, Тернопільська, Чернівецька - протягом останніх 7 років.
За останні вісім років (2000-2007 рр.) аналіз поширення ураження населення злоякісними новоутвореннями та зведення про захворювання великої худоби на лейкоз в Україні довів спільність в інтенсивності прояву епізоотичного та епідемічного процесів лейкозу, зумовленому загальними екологічними факторами ризику.
Найвищі рівні захворюваності людей злоякісними новоутвореннями характерні для таких областей країни, як Донецька, Харківська та Київська (461,9-500,6 на 100 тис. населення).
Традиційно невисокі рівні захворюваності людей зареєстровано в Закарпатській, Волинській, Івано-Франківській, Тернопільській та Чернівецькій областях (228,6-233,4 на 100 тис. населення). Тут спостерігається тенденція благополуччя щодо захворювання великої рогатої худоби на лейкоз.
Ідентифікація специфічних фрагментів ДНК ВЛ ВРХ у молоці за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. У доступній літературі майже відсутні дані про можливість застосування методу ПЛР для аналізу сирого незбираного молока з метою моніторингу ВЛ ВРХ. Такі дослідження дали б змогу визначити специфічність і чутливість методу на важливому обєкті: молозиві для годівлі молодняку ВРХ та сировині для виробництва молочної продукції. Крім того, використання молока для діагностики ВЛ ВРХ більш гуманне і дозволяє уникнути стресів для корів на різних стадіях лактації та ефективно здійснювати виробництво безпечної молочної продукції для споживачів.
Метою роботи даного розділу наших досліджень була адаптація методу ПЛР у реальному часі для виявлення вірусу лейкозу великої рогатої худоби в індивідуальних пробах молока.
При проведенні дворазових, з інтервалом у 30 діб, паралельних досліджень сироваток крові щодо виявлення в них специфічних антитіл ВЛ ВРХ у РІД та наявність специфічних фрагментів ДНК ВЛ ВРХ за ПЛР у реальному часі, поставлений за РІД діагноз не підтвердився у 18 тварин - серед них проби від 9 тварин дали негативну реакцію у РІД та ПЛР.
Для проведення досліджень на наступному етапі було сформовано дослідну групу тварин, які мали позитивні результати в РІД та ПЛР. Досліджували проби молока, отриманого від 14 корів, які за результатами дослідження проб крові з використанням методу ПЛР у реальному часі були позитивними та мали в ПЛР найвищі значення граничного циклу Ct по крові на виявлення провірусу ВЛ ВРХ.
Результати досліджень індивідуальних проб крові та молока методом ПЛР наведено в табл.1.
Таблиця 1
Результати порівняльних досліджень проб крові та молока методом ПЛР у реальному часі, Ст, n=14
Номер пробиСт крові Ст молока
Gp51 (FAM)PRP (JOE)gp51 (FAM)PRP (JOE)
12345
126,4224,0933,022,33
229,1223,30-25,31
325,6722,6036,7820,30
426,6823,6533,3521,40
524,4422,8736,7621,72
624,3923,2834,5223,15
733,6125,1838,7121,75
822,0020,9131,0719,49
933,6023, 1937,6319,86
1031,6920,5637, 1919,26
1128,9919,50-19,50
1222,3022,0933,0322,08
1324,2222,8834,3020,47
1433,2325,13-26,88
Лейкоцитарну ДНК із молока виділяли гуанідинтіоціонатним методом. Концентрацію ДНК вимірювали на спектрофотометрі Biofotomer (Eppendorf) за довжини хвилі 260 нм. Для одержання ДНК із більшою кількістю лейкоцитів проби молока в кількості 1,5 см3 центрифугували протягом 15 хв при 3000 об/хв.
Кожну пробу досліджували у двох повторах. Ампліфікацію проводили в реакційній суміші, обємом 25 мкл, що мала наступний склад: 1х ПЛР буфер, 2,5 ММ MGCL2, 1,5 ММ кожного із дезоксинуклеотидтрифосфатів, 5 ПМ праймерів для детекції провірусної ДНК, 2,5 ПМ флуоресцентних зондів, 2,5 ПМ праймерів для детекції фрагмента гена PRP,20 МКМ флуоресцентного барвника ROX, 0,2 u. урацил-ДНК-глікозилази (Fermentas) та 1 u. ДНК-полімерази. ДНК вносили у кількості 10-100 нг.
Ампліфікацію ДНК-мішені проводили на приладі ABI PRISM SDS 7000 (Applied Biosystems) із наступним температурним профілем: активація урацил-ДНК-глікозилази - 5 хв при 50° С, активація ДНК-полімерази - 9 хв при 94° С, та наступні 45 циклів ампліфікації, які включали денатурацію упровдовж 15 с при 95° С, відпал праймерів - 1 хв, при 60° С, елонгацію - 30 с при 72° С.
Для отримання якісних і вірогідних даних використовували серію контролів: негативний контроль - плазміда, що кодує фрагмент гену PRP; позитивний контроль - суміш двох плазмід, одна з яких кодує фрагмент провірусної ДНК лейкозу ВРХ, друга - фрагмент гена PRP, контроль без матриці (NTC) - замість ДНК у реакційну суміш додавали деіонізовану воду (18,2 М?).
Результати обробляли за допомогою програмного забезпечення ABI Prism 7000 Vs.1.2.3.
Цитологічні дослідження молока при лейкозі великої рогатої худоби. Кількісні показники соматичних клітин у молоці здорових і РІД - та ПЛР-позитивних на лейкоз корів, а також морфологію клітин вивчали у мазках, виготовлених із осаду після відстоювання або центрифугування молока та фарбування за методами Романовського-Гімза, Ньюманса та удосконаленою нами методикою.
Результати цитологічних досліджень мазків молока від РІД - та ПЛР-позитивних і здорових корів на третьому місяці лактації наведено в табл.2.
Таблиця 2
Цитологічний склад молока, отриманого від РІД - та ПЛР-позитивних на лейкоз корів, М±m, n=20
Клітини молокаПроби молока від
здорових корівРІД-позитивних корів
співвідношення, %співвідношення, %
Лейкоцити28-5950-66
Епітеліальні клітини11-233-7
Макрофаги5-77-11
Окремі ядра клітин3-63-5
Клітинний детрит4-58-11
Разом100100
Як свідчать наведені у табл.2 дані, більше половини клітин молока здорових корів (59%) складають лейкоцити, кількість яких збільшується у секреті молочної залози РІД - та ПЛР-позитивних на лейкоз корів (до 66 %).
Ми встановили, що кількість лейкоцитів у секреті молочної залози дослідних РІД - та ПЛР-позитивних на лейкоз, а також контрольних корів була різною навіть у корів-аналогів різного віку та рівня молочної продуктивності (табл.3).
Так, за даними, наведеними в табл.3, кількість лейкоцитів у молоці дослідних корів підвищується у 1,5-1,8 раза порівняно з контролем. Крім того, виявляється значне зростання кількості лейкоцитів, у першу чергу, за рахунок гранулоцитів. Одночасно відзначається збільшення кількості макрофагів. У секреті вимя позитивних на лейкоз корів траплялися гістіоцити та їх молоді форми, кількість яких в окремих корів складала до 20%, а також поодинокі плазмоцити.
Таблиця 3
Кількісні показники лейкоцитів у молоці РІД - та ПЛР-позитивних корів протягом лактації М±m, (тис/ см<3), n=20>Група тваринДруга лактаціяТретя лактація
коливанняМ±mколиванняМ±m
Дослід (РІД - та ПЛР-позитивні)330-520420±23**260-420360±42*
Контроль (здорові)120-380230±30140-350280±54
Примітка. Рівень вірогідності різниці з контролем, де *Р < 0,05; **Р < 0,01.
Кількість епітеліальних клітин у секреті вимя позитивних на лейкоз корів у 3 рази зменшується порівняно з молоком здорових корів. При цьому спостерігається збільшення зруйнованих клітин, вірніше їх залишків різної величини і форми. В окремих мазках їх буває так багато, що важко встановити їх походження.
Визначення фізико-хімічних показників молока, отриманого від РІД-та ПЛР-позитивних корів
Фізико-хімічні показники молока, отриманого від РІД - та ПЛР-позитивних корів, відрізняються від таких у клінічно здорових тварин (табл.4).
Густина молока в 1-й дослідній групі як у РІД - та ПЛР-позитивних, так і у здорових тварин, практично знаходилася на одному рівні, але кислотність була значно вищою в молоці, отриманому від РІД - та ПЛР-позитивних корів. Розбіжності між молоком, отриманим від дослідних і контрольних тварин, досягали 11,6%. Масова частка білка в молоці, отриманому від РІД - та ПЛР-позитивних корів, була нижчою (на 16,8%), ніж у молоці, отриманому від здорових тварин. Масова частка казеїну також знижувалася і знаходилася на рівні 89,1% по відношенню до контрольної групи (Р<0,001). Сухий знежирений молочний залишок (СЗМЗ) практично не зазнавав змін і перебував у межах фізіологічних коливань. Аналогічні зміни в молоці спостерігали і стосовно масової частки жиру, лактози, сухої речовини і золи.
Молоко, відібране від тварин 2-ї дослідної групи, практично не мало відмінностей за кислотністю і густиною порівняно з контролем, проте масова частка жиру в молоці, отриманому від РІД-позитивних тварин, була нижчою, ніж у контролі (Р<0,01). Масова частка білка та казеїну значно підвищувалася в молоці дослідної групи корів (на 19,2% і 9,5% відповідно). Результати даних змін статистично вірогідні при рівні значення Р<0,001.
Вміст сухого знежиреного молочного залишку, лактози і золи практично не зазнавав змін і знаходився в межах фізіологічних норм для клінічно здорових корів, а вміст сухої речовини в молоці, отриманому від РІД-позитивних тварин, значно знизився (на 20,5%); при цьому зниження було статистично вірогідним (Р<0,001).
У молоці корів 3-ї дослідної групи були вірогідно знижені числові значення густини, жиру, сухого знежиреного молочного залишку, лактози, золи і сухої речовини. Показники кислотності, білка і казеїну в молоці знаходилися в межах фізіологічних норм.
Таблиця 4
Фізико-хімічні показники молока клінічно здорових та РІД - та ПЛР-позитивних корів, М±m, %, n=6-9
Примітка. Рівень вірогідності різниці з контролем, де*Р < 0,05; **Р < 0,01; ***Р < 0,001.
За результатами проведених групових розрахунків густина молока, отриманого від РІД - та ПЛР - позитивних корів, знизилася на 6% порівняно з контролем. Виявляли й значне зниження масової частки жиру в молоці (на 13,6%) порівняно з таким, отриманим від здорових корів (Р<0,01). Що стосується інших показників, то вони були нижчими за контрольні величини на 6,6-10,9%.
Визначення мікробіологічних параметрів молока, отриманого від РІД - та ПЛР-позитивних корів. Результати проведених досліджень, які наведені в табл.5, свідчать, що у РІД - та ПЛР-позитивних корів усіх трьох дослідних груп кількість МАФАНМ молока вища (Р<0,001) порівняно зі здоровими.
У першій дослідній групі РІД - та ПЛР-позитивних корів, порівняно зі здоровими, загальна кількість мікроорганізмів у молоці перевищувала контроль у 2,2 раза, в другій - у 1,8, а в третій - у 2,5 раза.
Бактерії групи кишкових паличок та сальмонели в молоці як РІД-та ПЛР-позитивних, так і здорових корів усіх дослідних груп не було виявлено. При вивченні якісного складу мікрофлори молока встановлено, що бактерії в молоці від РІД-позитивних корів всіх дослідних груп представлені стафілококами. Виділено 4 культури, з яких Staphylococcus aureus - 3 культури та Staphylococcus epidermidis - 1 культура. Ізольована з молока РІД-позитивних корів стафілококова мікрофлора характеризується патогенними властивостями у 13,6 % випадків.
Таблиця 5
Мікробіологічні показники молока, отриманого від здорових і РІД - та ПЛР-позитивних корів, М±m, КУО/см<3, n=6-9>Група тваринМАФАНМ КУО/см3БГКППатогенні мікроорганізми, в т. ч. сальмонелиСтафілококи
Примітка. Рівень вірогідності різниці з контролем, де*** - Р<0,001.
Амінокислотний склад білків молока, отриманого від РІД - та ПЛР-позитивних корів. Результати досліджень з визначення сумарного вмісту незамінних амінокислот у молоці, отриманого від РІД - та ПЛР-позитивних і здорових корів, дещо різнилися (табл.6).
Співвідношення незамінних/замінних амінокислот у молоці зменшилося на 0,16 г/100 г білка. Вміст незамінних амінокислот (треонін, метіонін, аргінін, валін, гістидин, ізолейцин, лейцин, фенілаланін, лізин) знизився, а замінних - підвищився, що свідчить про погіршення біологічної цінності молока, отриманого від РІД - та ПЛР-позитивних корів.
Серед замінних амінокислот білка молока, отриманого від РІД-та ПЛР-позитивних корів, виявлено підвищення глутамінової кислоти на 49%, валіну - на 41, проліну - на 19% порівняно з аналогічними показниками молока контрольних корів. Встановлено підвищення на 37% вмісту триптофану в білку молока, отриманого від РІД - та ПЛР-позитивних корів.
Таблиця 6
Вміст амінокислот у молоці, отриманому від РІД - та ПЛР-позитивних та здорових корів, М ±m, n=10, г/100 г білка
АмінокислотиВміст амінокислот у білках молока корів
здоровіРІД - та ПЛР-позитивні
Замінні16,0718,53
У т. ч.: Аланін1,01 ±0,0121,14±0,011
Аргінін1,18±0,031,08±0,007
Аспарагінова кислота2,41±0,00171,95±0,004
Гістидин1,02±0,0010,97±0,008
Гліцин0,50±0,0060,76±0,005**
Глутамінова кислота4,08±0,0096,09±0,004*
Пролін2,68±0,0113,18±0,009*
Серин1,63±0,0051,41±0,004
Тирозин1,43±0,0071,78±0,003
Цистин0,13±0,0040,17±0,005
Незамінні11,5610,2
У т. ч. Валін0,96±0,0091,35±0,008
Ізолейцин1,09±0,0060,95±0,006
Лейцин2,81±0,0072,45±0,003
Лізин2,41±0,0071,92±0,004
Метіонін0,88±0,0010,61±0,001
Треонін1,3±0,0041,08±0,009
Фенілаланін1,69±0,0021,17±0,004
Триптофан0,49±0,0010,67±0,0003***
Співвідношення незамінних/замінних0,710,55
Примітка. Рівень вірогідності різниці з контролем, де *Р < 0,05; **Р < 0,01.
Мінеральний склад та технологічні властивості молока, отриманого від РІД - та ПЛР - позитивних корів. Молоко від РІД - та ПЛР-позитивних тварин не відрізнялося від такого у клінічно здорових корів. Воно мало нормальний природній вигляд, колір, запах і консистенцію. Кислотність досліджуваних проб коливалася у межах 16-170Т.
Як свідчать результати досліджень, наведених у табл.7, вміст макроелементів у молоці дослідних РІД - та ПЛР-позитивних корів знижувався (натрій - на 16%, калій - на 25, кальцій - на 18%), а мікроелементів - підвищувався (міді - на 19%, цинку - на 44%).
Таблиця 7
Мінеральний склад молока, отриманого від РІД - та ПЛР-позитивних та здорових корів, М ±m, мг/100 мл, n=10
Примітка. Рівень вірогідності з контролем, де *Р < 0,05; **Р < 0,01; ***Р < 0,001.
Токсико-біологічна оцінка молока, отриманого від РІД - та ПЛР-позитивних щодо лейкозу корів. Біологічну цінність молока від РІД-позитивних на лейкоз корів досліджували з використанням інфузорії Tetrachymena pyriformis. Розраховували показники відносної біологічної цінності (ВБЦ) продукту, а також вивчали можливу токсичну дію молока на найпростіших. Дослідні проби молока від РІД - та ПЛР-позитивних на лейкоз тварин були слабко токсичними. Відносна біологічна цінність молока становить 60 % порівняно з контролем, тобто знизилася на 40 %.
Вивчення інфекційних властивостей та впливу на організм дослідних мишей молока, отриманого від РІД-позитивних корів.
Зміни гемопоезу та кількісних показників крові дослідних лабораторних мишей. Дослідження проводили на мишах двох ліній С57 та CVA.
Здійснювали дослідження кількісних показників крові тварин. Визначали загальну кількість лейкоцитів та виводили лейкограму. Одержані дані представлено в табл.8.
Таблиця 8
Кількісні показники клітин крові дослідних і контрольних мишей, M±m,%, n=10
ПоказникиМиші, яким згодовували:
Молоко сире від РІД та ПЛР на лейкоз тварин (1 група)Молоко пастер. від РІД та ПЛР на лейкоз тварин (2 група)Молоко пастер. від здорових тварин (3 група - контроль)Стандартний раціон (4 група - контроль)
Як показує аналіз даних, наведених у таблиці 8, в усіх дослідних групах мишей молоді форми клітин крові та базофіли відсутні. У крові мишей, які споживали протягом 6 міс. сире і пастеризоване молоко від РІД - та ПЛР-позитивних на лейкоз корів, загальна кількість лейкоцитів зменшилася в 1,3 рази порівняно з контролем і знизилася за межу нижньої фізіологічної норми: кількість еозинофілів - у 1,2 рази, паличкоядерних нейтрофілів - у 1,7, сегментоядерних нейтрофілів - у 2,3 рази. Кількість еозинофілів та паличкоядерних нейтрофілів знаходилася в межах фізіологічної норми, а сегментоядерних нейтрофілів - знизилася, порівняно з фізіологічною межею нижньої норми. Відзначається зростання лімфоцитів у 1,4 рази, порівняно з контролем, моноцитів - у 1,2 рази. Проте ці показники знаходилися в межах верхньої межі норми. При згодовуванні мишам пастеризованого молока, отриманого від РІД-негативних корів, показники крові майже не змінювалися, порівняно з нормою.
У мазках периферійної крові від 20% дослідних мишей, яким згодовували сире незбиране молоко протягом 6 міс., спостерігали дегенеративні форми еритроцитів: макроцити, шизоцити, еритроцити з базофільною пунктуацією. В мазках кісткового мозку виявляли мітози в нормоцитах, велику кількість голих ядер, вакуолізацію цитоплазми нормобластів. У поліхроматофільних та оксифільних нормобластах встановлено ознаки дизеритропоезу, які проявлялись у вигляді дво - та триядерних клітин, каріорексису, фрагментації ядер.
Ці зміни свідчать про порушення нормальних процесів кровотворення в кістковому мозку та зниження функціональної активності гемопоетичних клітин.
Перед початком експерименту, на 120 добу та в кінці досліду проводили дослідження крові з використанням РІД та ПЛР. У мишей дослідних і контрольних груп за період спостережень сероконверсії та позитивних результатів ПЛР щодо ідентифікації BLV-DNA носійства не встановлено.
Морфологічні дослідження внутрішніх органів мишей, яким згодовували молоко, отримане від позитивно реагуючих за РІД та ПЛР на лейкоз корів. При патологоанатомічному розтині дослідних мишей у внутрішніх органах (селезінка, печінка, нирки, серце, тимус) макроскопічних змін не виявлено.
Абсолютна маса селезінки, тимуса, нирок контрольних і дослідних груп мишей не відрізнялася. Так, маса селезінки становила, г: 0,09±0,030, тимуса - 0,19 ±0,21, нирок - 0,38±0,11. Маса серця і печінки у дослідних групах мишей була дещо вищою порівняно з контрольними. Маса серця дослідних мишей знаходилися на рівні 0,14±0,006 г, контрольних - 0,10±0,001 г, маса печінки дослідних мишей була 1,48±0,022, контрольних - 1,32±0,012.
Під час дослідження клітинного складу препаратів-відбитків печінки та нирок змін, характерних для лейкозу, не виявлено.
У препаратах-відбитках селезінки встановили патологічні форми клітин у двох тварин з 1-ї та однієї тварини з 2-ї дослідних груп. Домінуючим типом клітин були лімфобласти. Деякі з лімфоцитів мали слабко зафарбоване ядро з пухкою структурою, а також ядра чотирикутної форми. Спостерігали розпад лімфоцитів, вакуолі в їх ядрі та цитоплазмі, нетипові гігантські клітини, такі у формі "дзеркальця", із сітчастою структурою та із співвідношенням ядра і цитоплазми 1: 2. Крім цього, виявляли так звані клітини лейколізу (тіні Боткіна-Гумпрехта). Поява останніх повязана з ламкістю мембран лейкемічних клітин, що призводить до їх руйнування при виготовленні мазків.
При гістологічних дослідженнях відзначено наступні мікроскопічні зміни. У чотирьох тварин з 1-ї групи, яким згодовували сире незбиране молоко та трьох тварин з 2-ї групи, яким згодовували пастеризоване молоко від РІД - та ПЛР-позитивних корів, в печінці спостерігали розширення й переповнення кровю синусоїдних капілярів і міжчасточкових вен, біля їх стінки виявляли скупчення клітин з ядрами чотирикутної форми, інтенсивно зафарбованих гематоксиліном. Траплялися ділянки з лізисом ядер клітин. У трьох тварин з 1-ї та двох тварин з 2-ї групи спостерігали скупчення незрілих форм лейкоцитів у просторах Діссе та навколо міжчасточкових судин; у двох тварин з 2-ї групи, яким згодовували пастеризоване молоко, виявили зернисту та жирову дистрофію гепатоцитів.
У двох тварин з 1-ї та однієї тварини з 2-ї групи судини міокарда були розширені та гіперемійовані.
При дослідженні селезінки у чотирьох тварин з 1-ї та двох тварин з 2-ї групи встановлено гіперплазію лімфоїдних вузликів (периартеріальна зона та світлий центр займають більшу, ніж за нормальних умов, площу, мантійна зона ущільнена).
Зміни до правил ветеринарно-санітарної оцінки молока при лейкозі великої рогатої худоби.
1. Молоко від серопозитивних тварин, яких утримують ізольовано від серонегативного стада, пастеризують у господарстві при температурі не нижче 80 0С протягом 30 хв, після чого його можна використовувати для згодовування тваринам, які знаходяться на відгодівлі у межах господарства. Крім того, таке молоко можна використовувати для подальшої переробки на сухе молоко для преміксів і кормів тваринам за наявності на молокопереробному підприємстві окремої лінії для приймання і переробки такого молока.
2. Молоко, отримане від серонегативних корів неблагополучного стада використовувати без обмежень за умов виконання вимог чинної "Інструкції з профілактики та оздоровлення великої рогатої худоби від лейкозу" (2008).У дисертаційній роботі отримано нові дані щодо динаміки змін показників якості та безпеки молока, отриманого від інфікованих на лейкоз корів (РІД - та ПЛР-позитивних). Вивчено епізоотичне значення та проведено аналіз ризиків під час згодовування такого молока. Науково обґрунтовано підходи до удосконалення ветеринарно-санітарної оцінки молока, отриманого від хворих та інфікованих на лейкоз корів.
1. Концептуальна система факторів сукупності ризику розвитку лейкозу великої рогатої худоби відстежує ендогенний, повязаний з особливостями організму (порода, спадковість, вік тварин), та екзогенний (екологічний, технологічний, біологічний) вплив на сприйнятливих тварин, що може бути використане з метою практичного застосування показників ризику при плануванні оздоровчих заходів та контролю отримання безпечної продукції належної якості.
2. Молоко, отримане від РІД - та ПЛР-позитивних корів залежно від року лактації має різні закономірності щодо якісних фізико-хімічних показників, які нижчі порівняно з молоком, отриманим від здорових корів. Так, у молоці корів четвертої лактації 1-ї дослідної групи встановлено зниження вмісту загального білка і казеїну на 19,5 та 12,0% відповідно. В 2-й дослідній групі, навпаки, виявлено підвищення загального білка і казеїну на 19,2 та 9,5% відповідно, а в 3-й - зниження цих показників на 10,0 і 10,7%.
3. Молоко, отримане від РІД - та ПЛР-позитивних корів, мало значне бактеріальне обсіменіння (в 1,8-2,6 раза вище за дані контролю). Стафілококова мікрофлора молока корів у 11,36% випадків відзначалася слабкопатогенними властивостями.
4. Встановлено, що за технологічними властивостями молоко, отримане від РІД-позитивних корів, відрізняється від молока здорових тварин зниженою класністю та є малопридатною сировиною для виробництва кисломолочної продукції і сирів. Вміст макроелементів у молоці дослідних РІД - та ПЛР-позитивних корів знижувався (натрій - на 16%, калій - на 25, кальцій - на 18%), а мікроелементів - підвищувався (міді - на 19%, цинку - 44%).
5. Вміст амінокислот характеризується змінами сумарної величини та співвідношення амінокислот в білку молока інфікованих тварин. Так, співвідношення незамінних/замінних амінокислот знизилося на 0,16 г/100 г білка. Серед замінних амінокислот у білку молока, отриманого від РІД - та ПЛР-позитивних корів, виявлено підвищення глутамінової кислоти на 49%, валіну - на 41, проліну - на 19%, порівняно з аналогічними показниками молока контрольних корів. Встановлено підвищення на 37% вмісту триптофану в молоці, отриманому від РІД - та ПЛР-позитивних корів.
6. Під час вивчення токсичності та відносної біологічної цінності з використанням інфузорії Tetrachymena piriformis встановлено, що молоко, отримане від інфікованих корів, слабкотоксичне зі зниженою (на 40 %) відносною біологічною цінністю.
7. Цитологічні зміни молока навіть на початку розвитку лейкозного процесу можуть бути використані як додатковий обєктивний тест для діагностики лейкозу. Секрет молочної залози РІД та ПЛР-позитивних корів складається: лейкоцити - 50-68%, епітеліальні клітини - 3-7, макрофаги - 7-11, клітинний детрит - 8-11%. Відбувається значне підвищення лейкоцитів (у 1,7 раза), в основному, за рахунок нейтрофілів. При цьому спостерігається збільшення зруйнованих клітин, вірніше, їх залишків різної величини та форми.
8. Встановлено, що метод полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі дає можливість виявляти вірусспецифічні фрагменти ДНК вірусу лейкозу великої рогатої худоби у молоці корів. Використання цього методу з пробами молока має важливе практичне значення в молозивний період, особливо для племінних тварин і корів-первісток.
9. Морфологічні зміни у внутрішніх органах мишей, яким згодовували молоко, отримане від інфікованих лейкозом корів (гостра венозна гіперемія міокарда, печінки, зерниста та жирова дистрофія гепатоцитів, гіперплазія лімфоїдних вузликів селезінки), свідчать про негативний вплив молока на організм дослідних тварин.
10. У 20% піддослідних мишей, яким згодовували пастеризоване молоко від інфікованих лейкозом корів, виявлені у препаратах-відбитках селезінки зміни, характерні для розвитку лейкозного процесу, що є високим ступенем ризику використання такого молока для споживачів.
Пропозиції виробництву: Для ветеринарно-санітарної експертизи молока, отриманого від РІД та ПЛР-позитивних корів, запропоновано: 1." Методичні рекомендації з ветеринарно-санітарної експертизи молока та мяса, отриманих від великої рогатої худоби, хворої на лейкоз", затверджені науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (протокол №1 від 20 грудня 2007 року).
2. "Спосіб фарбування мазків молока для цитологічного дослідження", деклараційний патент на корисну модель 31575 Україна, G01Т1/00, Бюл. № 7 від 10.04.2008 р.
3. Метод ПЛР у реальному часі з використанням проб сирого незбираного молока можна використовувати для моніторингу ВЛ ВРХ у благополучних та контролю безпечності сировини від серонегативного стада у неблагополучних господарствах.
Список литературы
1. Біологічна цінність і токсичність молока та мяса при лейкозі великої рогатої худоби / О.М. Якубчак, Г.В. Козловська, Т.В. Таран, Р.І. Білик [та ін.] // Ветеринарна біотехнологія - К., 2007. - № 10. - С.230-235 (здобувач самостійно проводив експериментальну частину роботи та статистичну обробку даних)
2. Якубчак О.М. Фізико-хімічні показники молока, отриманого від серопозитивних на лейкоз корів / О.М. Якубчак, Р.І. Білик // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини. зб. наук. праць. - Харків, 2007. - Вип.14 (39). - Ч.2. - Т.1. - С.235-237 (здобувач самостійно проводив експериментальну частину роботи та статистичну обробку даних та підготовку матеріалів до друку).
3. Білик Р.І. Моніторинг мікробіологічних показників молока, отриманого від РІД-позитивних корів / О.М. Якубчак, Н.А. Меженська, Р.І. Білик, І.В. Семенчукова // Збірник наукових праць Луганського національного аграрного університету. - Луганськ: ЛНАУ, 2007. - № 78/10 1 - (Ветеринарні науки). - С.44-48 (здобувач самостійно проводив експериментальну частину роботи та статистичну обробку даних та підготовку матеріалів до друку).
4. Білик Р.І. Вивчення інфекційних властивостей та впливу на організм дослідних мишей молока, отриманого від РІД-позитивних на лейкоз корів / Р.І. Білик // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.Ж. Гжицького - Львів, 2007. - Т.9, №2 (33). - С.129-133.
5. Білик Р.І. Моніторинг сезонних змін показників якості молока при лейкозі великої рогатої худоби: матеріали ІІІ міжвузівської наук. - практ. конф. студентів, аспірантів та молодих вчених О.М. Якубчак, Н.А. Меженська, Р.І. Білик [та ін.]. - Житомир: ЖДУ ім.І. Франка, 2007. - С.3-5 (здобувач самостійно проводив експериментальну частину роботи та статистичну обробку даних та підготовку матеріалів до друку).
6. Якубчак О.М., Білик Р.І. Характеристика амінокислотного складу молока, отриманого від серопозитивних на лейкоз корів / О.М. Якубчак, Р.І. Білик // Науково-теоретичний вісник ДАУ. - Житомир, 2007. - Вип. №2 (19). - Т.1. - С.71-75 (здобувач самостійно проводив експериментальну частину роботи та статистичну обробку даних та підготовку матеріалів до друку).
7. Якубчак О. Зміни лейкоцитів крові дослідних мишей при згодовуванні їм молока та мяса, отриманих від РІД-позитивних на лейкоз корів/ О. Якубчак, Т. Таран, Р. Білик // Ветеринарна медицина України. - 2008. - №1. - С.16-18. (здобувач самостійно проводив експериментальну частину роботи та статистичну обробку даних).
8. Перспективи діагностики лейкозу великої рогатої худоби методом ПЛР із використанням проб молока / Р.І. Білик, Л.М. Іщенко, С.Д. Мельничук [та ін.] // Вісник Полтавської державної аграрної академії. - 2008. - № 1. - С.109-111 (здобувач самостійно проводив експериментальну частину роботи та статистичну обробку даних та підготовку матеріалів до друку).
9. Білик Р.І. Мінеральний склад та технологічні властивості молока, отриманого від РІД-позитивних корів /Р.І. Білик // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини: зб. наук. праць. - Харків, 2007. - Вип.16 (41). - Ч.2. - Т.1. - С.95-98.
10. Методичні рекомендації з ветеринарно-санітарної експертизи молока та мяса, отриманих від великої рогатої худоби, хворої на лейкоз: розглянуті та затверджені науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України, протокол № 1 від 20 грудня 2007 року / О.М. Якубчак, В.О. Бусол, Р.І. Білик. - К.: НАУ, 2008. - 29 с. (здобувач самостійно проводив експериментальну частину роботи з удосконалення ветеринарно-санітарної експертизи молока та підготовку матеріалів до друку).
11. Пат.31575 Україна, G01Т1/00. Спосіб фарбування мазків молока для цитологічного дослідження / Якубчак О.М., Білик Р.І., Таран Т. В.; заявник і патентовласник Національний аграрний університет Заявлено 28.11.2007; Опубл.10.04.2008 Бюл. № 7 від 10.04.2008 р. - 2 с. (здобувач самостійно проводив експериментальну частину роботи та підготовив матеріали заявки).
12. Морфологічні дослідження внутрішніх органів мишей, яким згодовували молоко та мясо від позитивно реагуючих за РІД на лейкоз корів / Р.І. Білик, О.М. Якубчак, Т.В. Таран, Я.К. Сердюков // Науково-теоретичний збірник Вісник ДАЕУ. - Вип. № 1 (21). Т.1 - Житомир: ДАЕУ, 2008 р. - С.52-55. (здобувач самостійно проводив експериментальну частину роботи та статистичну обробку даних та підготовку матеріалів до друку).
13. Билык Р.И. Молоко как объект исследования для ПЦР-диагностики лейкоза крупного рогатого скота: материалы Междунар. науч. - практ. конф., 5-8 февр. 2008 г. / Р.И. Билык, О.Н. Якубчак, Н.А. Меженская // - пос. Персиановский: [б. и.], - С.4-6. (здобувач самостійно проводив експериментальну частину роботи та статистичну обробку даних та підготовку матеріалів до друку).
14. Білик Р.І. Зміни амінокислотного складу мязової тканини та внутрішніх органів, отриманих від хворих на лейкоз корів: матеріали VI Міжнар. конгресу спеціалістів ветеринарної медицини присвячений 110-річчю НАУ, (6-10 жовт. 2008р.) / О.М. Якубчак, Т.В. Таран, Р.І. Білик //. - К.: [б. в.], 2008. - С.145-149.
15. Білик Р.І. Результати мікроскопії мазків-відбитків продуктів забою, отриманих від РІД-позитивних на лейкоз корів: матеріали VI Міжнар. конгресу спеціалістів ветеринарної медицини присвячений 110-річчю НАУ, (6-10 жовт. 2008р.) / О.М. Якубчак, Т.В. Таран, Р.І. Білик // - К.: [б. в.], 2008. - С.166-167.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
