Результати обстеження промислових насаджень гербери на вірусоносійство. Дослідження властивостей виявлених збудників вірусних хвороб. Встановлення кореляції між візуальними симптомами на гербері і наявністю антигенів вірусів в уражених рослинах.
При низкой оригинальности работы "Вірусні хвороби гербери (Gerbera jamesonii Bolus ex Hook) та біотехнологічні прийоми отримання її безвірусного посадкового матеріалу", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Адже в умовах сучасного інтенсивного промислового квітникарства одним з факторів, що обмежує продуктивність та розвиток декоративно-квіткових культур, є фітовірусні інфекції, які викликають погіршення декоративних якостей та фізіологічного стану рослин, що в кінцевому рахунку призводить до значних економічних збитків, а саме - зниженню врожаю на 40-70% (Митрофанова, 2001). До економічно вигідних культур, що в умовах захищеного ґрунту розмножуються вегетативно, а звільнення від вірусів є особливо доцільним, належать і гібридні форми Гербери Джеймсона (Gerbera jamesonii Bolus ex Hook). Більшість методів захисту рослин від фітопатогенних вірусів виявляють опосередковану дію й орієнтовані на скорочення резервуарів інфекції, зменшення розповсюдження вірусів переносниками та зменшення шкодочинного впливу вірусу на рослину через підвищення стійкості рослин до цих патогенів, виведення вірусостійких сортів, а також отримання посадкового матеріалу на безвірусній основі. Дисертаційна робота виконувалася в межах науково-дослідної роботи кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка за темами: „Дослідити закономірності патогенезу фітовірусних інфекцій з метою раціонального використання природних ресурсів”, держбюджетна тема 97089 (номер державної реєстрації 0197U003157) та „Моніторинг збудників вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих технологій вирощування сільськогосподарських культур”, держбюджетна тема 01БФ036-01 (номер державної реєстрації 0101U005076). Мета і завдання дослідження У звязку з економічною перспективністю культури гербери метою досліджень було обстеження її промислових насаджень, виявлення та ідентифікація збудників вірусних хвороб і розробка можливих шляхів отримання безвірусного посадкового матеріалу цієї культури.За період 1997 - 2002 роки досліджувались тепличні господарства міста Києва: ВАТ „Агрофірма Троянда”, держагрофірма „Квіти України” та СТОВ „Теремки”. Найпоширенішими з них були хлороз, мозаїка, некротизація, закручування листкової пластинки та затримка розвитку рослини. Найгірший фітосанітарний стан мали рослини ВАТ „Агрофірма Троянда”, де основними симптомами були зморшкуватість листкової пластинки, жовтяниця, хлороз, некротизація та затримка розвитку. Адже симптоми, подібні до вірусних, можуть зявлятися на рослинах і внаслідок пошкодження комахами та нематодами, ураження грибами та бактеріями або через порушення агротехнічних умов вирощування рослин. За допомогою ІФА нами показано відповідність між візуальними симптомами, описаними раніше, і наявністю вірусних антигенів в уражених рослинах, що свідчить про вірусну природу захворювання; показано можливість прихованої вірусної інфекції, яка становить загрозу за мультиплікації посадкового матеріалу; а також виявлено антигенні білки не описаного раніше вірусу, які реагували з сироватками до різних вірусів з родини Potyviridae (табл.Вперше в Україні проведено вірусологічне обстеження промислових насаджень гербери ВАТ „Агрофірма Троянда”, СТОВ „Теремки”, держагрофірми „Квіти України” та селекційного комплексу гербери в Нікітському ботанічному саду Національного наукового центру УААН. Виявлено методами електронної мікроскопії, імуноферментного аналізу та біотестування неописаний раніше на гербері патоген вірусної природи. Методом електронної мікроскопії показано, що гербера (Gerbera jamesonii Bolus ex Hook) уражується трьома вірусами паличковидної, ізометричної та нитковидної форми.
План
2. Основний зміст роботи
Вывод
Обстеження промислових насаджень гербери на наявність вірусної інфекції. Свою роботу ми почали з візуальних обстежень підприємств, котрі вирощують герберу. За період 1997 - 2002 роки досліджувались тепличні господарства міста Києва: ВАТ „Агрофірма Троянда”, держагрофірма „Квіти України” та СТОВ „Теремки”. Крім цих господарств, нами проводилось обстеження селекційного комплексу гербери
Таблиця 1 Результати візуальних обстежень промислових насаджень гербери в досліджених нами господарствах
Господарства Симптоми„Агрофірма Троянда”„Квіти України”„Теремки”НБС
зміна забарвлення суцвіття9,4±0,42,5±0,1не виявлено5,1±0,1
в Нікітському ботанічному саду Національного наукового центру УААН. У всіх господарствах, за винятком СТОВ „Теремки”, симптоми ураження були подібними, незважаючи на значні відмінності за географічним розташуванням, екологічними умовами вирощування та сортовими особливостями (табл. 1).
Найпоширенішими з них були хлороз, мозаїка, некротизація, закручування листкової пластинки та затримка розвитку рослини. Найгірший фітосанітарний стан мали рослини ВАТ „Агрофірма Троянда”, де основними симптомами були зморшкуватість листкової пластинки, жовтяниця, хлороз, некротизація та затримка розвитку. Дещо краща картина спостерігалась у держагрофірмі „Квіти України”. Найпоширенішими симптомами тут були: лійковидне закручення та мозаїчність листкової пластинки. Можливо, таку картину можна пояснити тим, що ці господарства вирощували рослини гербери впродовж чотирьох та більше років і за досить тривалий проміжок часу відбувалось перезараження рослин різними фітопатогенами.
При візуальному обстеженні рослин СТОВ “Теремки”, де ретельно дотримувались агротехнічних умов вирощування, нами реєструвались лише поодинокі мало виражені симптоми мозаїки, хлорозу та зморшкуватості листкової пластинки.
Необхідно зазначити, що київські підприємства вирощують переважно імпортовану герберу на відміну від Нікітського ботанічного саду, де розводять сорти власної селекції.
На рослинах з вищеназваними симптомами в багатьох випадках були зареєстровані комахи-шкідники, які можуть виступати переносниками вірусів.
Для зясування природи ушкодження рослин гербери ми застосували метод непрямого імуноферментного аналізу. Адже симптоми, подібні до вірусних, можуть зявлятися на рослинах і внаслідок пошкодження комахами та нематодами, ураження грибами та бактеріями або через порушення агротехнічних умов вирощування рослин.
В ході експерименту була здійснена постановка ІФА з рослинним матеріалом гербери окремо по кожному з обстежених господарств.
За допомогою ІФА нами показано відповідність між візуальними симптомами, описаними раніше, і наявністю вірусних антигенів в уражених рослинах, що свідчить про вірусну природу захворювання; показано можливість прихованої вірусної інфекції, яка становить загрозу за мультиплікації посадкового матеріалу; а також виявлено антигенні білки не описаного раніше вірусу, які реагували з сироватками до різних вірусів з родини Potyviridae (табл. 2).
Таблиця 2 Результати виявлення вірусних антигенів методом непрямого ІФА
Назва господарства„Агрофірма Троянда”„Квіти України”„Теремки”НБС
Виявлені антигениУВК, ВПЗПУВК, ВТМВТМВТМ, ВПЗП
Поряд з ІФА ми застосовували метод електронної мікроскопії (ЕМ) та біотестування. Для дослідження використовували надземну частину уражених рослин. Досліджуючи матеріал за допомогою трансмісивної електронної мікроскопії, ми виявляли різні за морфологією вірусні частки, які мали вигляд гнучких і жорстких паличок та сферичних поліморфних часток (табл. 3).
Паличковидний вірус, за морфологічними показниками подібний до вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ), виявлявся у держагрофірмі „Квіти України” та СТОВ „Теремки”. Рослини саме цих господарств у реакції ІФА реагували з імунною сироваткою до ВТМ. Поєднання результатів ІФА та ЕМ дають підставу стверджувати, що рослини гербери держагрофірми „Квіти України” та СТОВ „Теремки” були інфіковані саме ВТМ. Ікосаедричний вірус реєструвався лише у ВАТ „Агрофірма Троянда” і, ймовірно, є вірусом плямистого зівянення томатів, що підтверджується даними ІФА соку рослин цього господарства.
Таблиця 3 Дослідження інфекційного соку з рослин гербери методом електронної мікроскопії
ГосподарстваМорфологія віріонів
сферичні d, нмпаличковидні, нмниткуваті, нм
Агрофірма Троянда80±5-705±4 Ч 13 нм
Квіти України-300±2 Ч 18705±4 Ч 13 нм
Теремки-300±2 Ч 18-
На нашу думку, найцікавішими є нитковидні вірусні частки довжиною близько 705 нм. співвідношення довжини та ширини віріона складає 54,44 ± 0,01. Зразки рослинного матеріалу, в яких виявлявся цей вірус в реакції ІФА, реагували з сироваткою до Y-вірусу картоплі, хоча літературних відомостей про ураження гербери потівірусами ми не знайшли.
Характеристика нитковидного вірусу, виявленого на гербері. Для зясування біологічних властивостей виявленого вірусу нами було проведено тестування на рослинах-індикаторах, які інфікували методом механічної інокуляції соком з уражених рослин гербери. Симптоми захворювання розвивались протягом 2 - 4 тижнів з моменту зараження (табл. 4).
Таблиця 4 Реакція рослин-індикаторів на зараження виявленим потівірусом
Рослини-індикаториСимптоми
локальнісистемні
Datura stramonium L.відсутнінекрози
Gomphrena globosa L.некрози з червоною облямівкоювідсутні
Chenopodium amaranticolor Coste et Reyn.відсутністроката мозаїка
Nicotiana glutinosa L.відсутнівідсутні
N. tabacum cv. Trapesonвідсутнівідсутні
N. tabacum cv. Samsunвідсутнівідсутні
Tetragonia expansa Murr.відсутнінекрози
Licopersicon esculentum Mill.відсутнімозаїка
Petunia hibrida Hort.відсутнівідсутні
Симптоми, розвиток яких ми спостерігали на рослинах-індикаторах, підтверджують інфекційну природу збудника, а в поєднанні з результатами ІФА та ЕМ дають підставу стверджувати про вірусну етіологію захворювання.
Подальше дослідження виявленого вірусу було спрямоване на його виділення та концентрацію. Після трьох циклів диференційного центрифугування ми визначали чистоту виділеного вірусного препарату спектрофотометричним методом. Для цього вимірювали спектр поглинання ультрафіолетового випромінювання в межах довжини хвилі 240 - 300 нм. (Калинина и др.,1998) і визначали співвідношення Е260/280, яке становило 1,32.
З метою отримання додаткової інформації про виділений вірус та для визначення молекулярної маси структурного білка виділеного вірусу було проведено аналітичний електрофорез у поліакриламідному гелі за Лемлі з використанням ДСН (ПААГ - ДСН).
В треках кожного з дослідних зразків спостерігався один основний білковий компонент. Обрахунок молекулярної маси його, за калібровочною кривою залежності lg молекулярних мас від довжини пробігу маркерних білків, становив 36 ± 0,5 КДА
У треках з дослідними зразками також спостерігалась незначна кількість поліпептидів з молекулярними масами більше 40 КДА. Оскільки концентрація цих білків не залежала від способу очистки вірусного препарату, ми вважаємо, що це є домішки рослинних білків, які теж виявлялися спектрофотометрично.
Отримання безвірусного посадкового матеріалу гербери Gerbera jamesonii Bolus ex Hook. Біотехнологічний процес отримання та вирощування безвірусного посадкового матеріалу - багатостадійний. На першому етапі проводили пошук здорових рослин, які б могли бути використані для подальшої мультиплікації. Рослини без зовнішніх симптомів ураження перевіряли на вірусоносійство методом ІФА.
У своїй роботі для введення гербери в культуру in vitro ми використовували квіткові бруньки рослин, котрі не давали позитивної реакції на наявність вірусів методом ІФА. Використовуючи диски з листкової пластинки, ми отримали калус, проте регенерації рослинного організму з цього калусу не відбувалось.
Обовязковим етапом отримання асептичної культури рослинних клітин, тканин або окремих органів in vitro є стерилізація вихідного матеріалу. В нашій роботі ми порівнювали дію різних стерилізуючих агентів на експланти гербери, зокрема: етилового спирту, хлораміну, розчину гіпохлориту кальцію, перекису водню та комерційного препарату - тимеросалу. Експериментальним шляхом було підібрано оптимальні умови стерилізації квіткових бруньок гербери, які полягають у послідовній стерилізації в розчинах 1% хлораміну (7 хв.), 1% тимеросалу (8 хв.) та 70% етанолу (1 хв.).
Після стерилізації для звільнення від ендогенних фітогормонів квіткові бруньки висаджували на живильне середовище, позбавлене регуляторів росту, а через 7 - 10 діб субкультивували життєздатні, не контаміновані мікрофлорою експланти на повноцінне середовище.
Відомо, що регенерація та клональне мікророзмноження рослин гербери дещо ускладнені у звязку з відмінністю морфогенетичної реакції різних її сортів на склад поживного середовища та співвідношення регуляторів росту. Через це умови для кожного сорту доводиться підбирати окремо. Нам вдалося індукувати непряму регенерацію рослин гербери сортів „Роулетта" та „Циган"
У своїх дослідженнях за основу всіх модифікацій ми використовували поживне середовище Мурасіге-Скуга, яке за літературними джерелами найчастіше використовується для інших культур (Murashige & Skoog, 1962). Змінюючи концентрацію та співвідношення мінеральних солей, а також вітамінів та регуляторів росту, ми оцінювали ефективність кожної модифікації за здатністю індукувати регенерацію рослин, за швидкістю регенерації та морфологією отриманих регенерантів. Серед усіх перевірених модифікацій нами було відібрано чотири основних (табл. 5).
Нами експериментально було визначено умови культивування та клонального мікророзмноження гербери in vitro, термін непрямої регенерації пагонів, який складав 2 - 6 тижнів у різних варіантах поживного середовища, а також визначено максимальний термін культивування калусної тканини в наших модифікаціях поживного середовища. Він становив 11 - 12 місяців. Адже за тривалого багатократного субкультивування калусної тканини в її клітинах накопичується цитогенетична мінливість, яка призводить до втрати здатності пагоно- та коренеутворення (Калинин и др., 1992). З іншого боку, відомо, що високі концентрації фітогормонів впливають на морфофізіологічні особливості рослин, зокрема підвищення концентрації цитокінінів може спричинити збільшення частоти виникнення хромосомних аберацій і виникнення аномальних пагонів (Мелик-Саркисов и др., 1994).
Таблиця 5 Склад підібраних поживних середовищ для культивування гербери in vitro
Варіанти КомпонентиКонцентрація компонентів поживного середовища (мг/л)
1234
макроелементиMSЅ MSMSMS
мікроелементиMSMSMSХеллера
хелатоване залізоMSMSMSMS
сахароза30000300004500030000
NH4H2PO4--85-
аденін-сульфат10101010
гліцин10101010
мезоінозитол100100100100
тіамін-HCL5005003010
піридоксин-HCL1251251010
нікотинамід25025010-
кальцію D ( ) пантотенат250250--
холінхлорид125125--
р-амінобензонат2525--
біотин2,52,52,52,5
цианокобаламін2,52,5--
БАП551010
ІОК--0,5-
НОК0,10,3-1
агар7000700070007000
РН5,55,55,55,5
Укорінення рослин-регенерантів гербери ми проводили на поживному середовищі, яке відрізнялося від стандартного підвищеною концентрацію сахарози та НОК (табл. 6), оскільки стимуляція коренеутворення є найбільш вираженим органогенним ефектом для ауксинів.
На основі розробленої біологічної технології нам вдалося отримати вільні від вірусу рослини гербери.
Таблиця 6 Склад поживного середовища для коренеутворення
КомпонентиКонцентрація (мг/л)
макроелементиЅ MS
мікроелементиЅ MS
хелатоване залізоЅ MS
сахароза20 000
НОК1
агар7000
РН5,5
Вперше в Україні проведено вірусологічне обстеження промислових насаджень гербери ВАТ „Агрофірма Троянда”, СТОВ „Теремки”, держагрофірми „Квіти України” та селекційного комплексу гербери в Нікітському ботанічному саду Національного наукового центру УААН.
Виявлено методами електронної мікроскопії, імуноферментного аналізу та біотестування неописаний раніше на гербері патоген вірусної природи.
Методом електронної мікроскопії показано, що гербера (Gerbera jamesonii Bolus ex Hook) уражується трьома вірусами паличковидної, ізометричної та нитковидної форми. Визначено морфологічні особливості цих вірусів: паличковидний - 300±2 нм. Ч 18 нм., сферичний - 80±5 нм., ниткоподібний - 705±4нм. Ч 13 нм.
Зясовано методом непрямого імуноферментного аналізу, що паличковидний вірус є вірусом тютюнової мозаїки, сферичний - вірусом плямистого зівянення томатів, а також встановлено подібність серологічних властивостей ниткоподібного вірусу до представників родини Potyviridae.
Досліджено коло рослин-індикаторів виявленого ниткоподібного вірусу: Gomphrena globosa L. реагує локальними некрозами з червоною облямівкою, Datura stramonium L. і Tetragonia expansa Murr. - системними некрозами, Chenopodium amaranticolor Coste et Reyn. - строкатою мозаїкою, Licopersicon esculentum Mill - мозаїкою.
Експериментально підібрано умови введення гербери в культуру in vitro, які передбачають час відбору первинних експлантів - з кінця жовтня до початку січня, - та умови їх стерилізації, які полягають у послідовній стерилізації в розчинах хлораміну, тимеросалу та етанолу.
Модифіковано склад поживного середовища для культивування гербери in vitro за рахунок зміни концентрації та співвідношення мінеральних компонентів і регуляторів росту, що дозволило прискорити процес мікроклонального розмноження цієї культури.
На основі розробленої технології отримано вільні від вірусу рослини - донори гербери сортів „Роулетта” та „Циган”, які знаходились у промисловому вирощуванні у ВАТ „Агрофірма Троянда”.
Список литературы
1. Компанець Т.А., Сенчугова Н.А., Бойко А.Л. Обстеження гербери на вірусоносійство за допомогою імуноферментного аналізу // Вісник КНУ Сер. Біол. - 2000. - № 31. - С. 50 - 51.
2. Компанець Т.А. Отримання безвірусного посадкового матеріалу гербери (Gerbera jamesonii Bolus ex Hook) // Вісник КНУ Сер. Біол. - 2001. - № 33. - С. 53 -54.
3. Компанець Т.А., Сенчугова Н.А., Снігур Г.А. Про новий вірус Gerbera Jamesonii Bolus ex Hook // Вісник КНУ Сер. Біол. - 2001. - №. 35. - С. 28 - 30.
4. Поліщук В.П., Бойко О. А., Муж Г.В., Молчанець О.В., Бисов А.С., Капустіна Н.О., Компанець Т.А., Колонюк І.О. Потівіруси в агроценозах // Захист рослин. - 2001.- № 12. - С. 19 - 20.
5. Компанець Т.А. Вплив різних стерилізуючих хімічних речовин на клітини Gerbera jamesonii при клональному мікророзмноженні // Мат. Міжн. конф. „Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі”. - Львів. - 1998. - С.210 - 211.
6. Компанець Т.А., Сенчугова Н.А., Яцковська Л.І., Дулевич Ж.А. Біотехнологія отримання оздоровленого посадкового матеріалу Gerbera jamesonii Bolus ex Hook // Мат. II Міжн. конф. „Біоресурси та віруси". - Київ. - 1998. - С. 88, 193.
7. Практикум із загальної вірусології: Навчальнй посібник / А.Л.Бойко, В.П.Поліщук, Л.В.Токарчук, Ж.А.Дулевич, Н.В.Тайкова, О.А.Кондратюк, О.В.Молчанець, Т.А.Компанець / За ред. А.Л. Бойка. - К.: Видавничий центр „Київський університет", 2000. - 270 с.
8. Компанець Т.А., Сенчугова Н.А., Дулевич Ж.А., Снігур Г.А. Про новий вірус Gerbera jamesonii Bolus ex Hook // Мат. ІІІ Міжн. конф. „Біоресурси та віруси". - Київ. - 2001. - С. 79, 185.
9. Компанец Т., Сенчугова Н., Снигур Г. Получение безвирусного посадочного материала герберы (Gerbera jamesonii Bolus ex Hook) // Науч. тр. Литовского института садоводства и овощеводства и Литовского сельскохозяйственного университета. - 2001. - Т. 20(4)-2. - С. 73 - 79.
10. T.A.Kompanets, N.A.Senchugova, G.A.Snigur The obtaining of the Gerbera jamesonii Bolus ex Hook virus-free planting material // Proc. International symposium "Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources". - Yalta. - 2002. - P. 45.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
