Участие митохондриального АТФ-ингибируемого калиевого канала в адаптации животного к гипоксическому состоянию - Дипломная работа

……………………………………………………………………...…. Глава 1. Обзор литературы ……………………………………….……….......... 1.1 Системы транспорта ионов калия в митохондриях ………………………. 1.2 Свойства и регуляция митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала……………………………………………………………………………… 1.3 Фармакологическая модуляция митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала ………………………………………………………………... 1.4 Структура митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала …… 1.5 Нарушения гомеостаза, вызванные гипоксией и механизмы его восстановления …………………………………………………………………. Материалы и методы ………………………………………………… 2.1 Выделение белка с молекулярной массой 55 кДа из митохондрий печени крыс……………………………………………………………………………… 2.1.1 Выделение митопластов из митохондрий печени крыс………………... 2.1.2 Экстрагирование белков из митопластов……………………………….. 2.1.3 Отделение водорастворимых белков от нерастворимых………………. 2.1.4 Ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе…………………… 2.1.5 SDS-электрофорез в ПААГ………………………………………………. 2.1.6 Определение проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ)…. 2.1.7 Нативный электрофорез………………………………………………….. 2.1.8 Концентрирование белка методом обратного диализа с помощью полиэтиленгликоля …………………………………………………………...… 2.2 Выделение митохондрий из печени крыс………………………………..... 2.4 Выделение митохондрий из сердца крыс…………………………………. 2.5 Определение параметров транспорта К с помощью К -селективного электрода…………………………………………………….. 2.6 Определение параметров дыхания с помощью кислородного электрода Кларка…………………………………………………………………………… 2.7 Спектрофотометрическое определение скорости набухания митохондрий……………………………………………………………………. 2.8 Определение устойчивости к гипоксии крыс и адаптация к ней низкоустойчивых крыс………………………………………………………… Глава 3. Список сокращений БЛМ - бислойные липидные мембраны митоКАТФ - митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал. АФК - активные формы кислорода. митоKIR - канальная субъединица митоКАТФ митоSUR - регуляторная субъединица митоКАТФ ДЕБ - п-диметиламиноэтилбензоат GSH/GSSG - окисленная / восстановленная форма глутатиона МЭ - 2-меркаптоэтанол ТЕМЕД - N,N,N,N-Тетраметилэтилендиамин Тris - трис(гидроксиметил)метиламин ПЭГ - полиэтиленгликоль НУ - низкоустойчивые животные ВУ - высокоустойчивые животные А - адаптированные животные 5- НD - 5-гидроксидеканоат HEPES - N-2-гидроксиэтилперазин-N’-этансульфоновая кислота Введение Любое патологическое состояние прямо или косвенно связано с нарушением кислородного гомеостаза организма. В настоящее время многие исследователи склоняются к тому, что активация митохондриального АТФ-ингибируемого калиевого канала является важным моментом в адаптации к гипоксии. Следует отметить, что этот канал был впервые изолирован из внутренней митохондриальной мембраны в лаборатории митохондриального транспорта [4], и в настоящее время проводится изучение его свойств [42]. Системы транспорта ионов калия в митохондриях Известно, что во внутренней мембране митохондрий локализуются ферменты синтеза АТФ, системы транспорта ионов и субстратов дыхания, а также переносчики электронов дыхательной цепи. Однако, еще в 1981 году в лаборатории митохондриального транспорта Г. Д. Мироновой [4], а в дальнейшем и другими исследователями [17], из внутренней мембраны митохондрий был выделен селективный для калия канал, выполняющий функцию унипортера, причем антитела к этому белку-каналу специфически ингибировали работу данного канала, не влияя на другие функции митохондрий [6]. К настоящему времени митоКАТФ был обнаружен во внутренней мембране интактных митохондрий методом петч-кламп в нескольких лабораториях [12, 15, 20, 31, 45, 64]. Модуляторы митоКАТФ митоКАТФ и цитоКАТФ цитоКАТФ Активаторы диазоксид никорандил BMS-180448 BMS-191095 ДЕБ Тестостерон УДФ кромакалим пинацидил Р-1060 силденафил изофуран EMD60480 априкалим P-1075 ?- эстрадиол МСС-134 Ингибиторы 5-HD МСС-134 глибенкламид HMR1098(1833) Глимепирид Селективность действия модулятора зависит от типа изучаемых клеток, условий эксперимента и, в основном, от используемых концентраций. Диазоксид и никорандил, например, активируют не только митоКАТФ, но в более высоких концентрациях также активируют и цитоКАТФ [16,58]; 5-HD помимо митоКАТФ ингибирует при низких значениях рН цитоКАТФ, активируемый АДФ [47]. Структура митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала Структура цитоКАТФ и ген ее кодирующий к настоящему времени известны.