Структурно-функціональні властивості гемаглютиніну і нейрамінідази різних штамів віруса грипу Н9N2 - Автореферат

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені В. Н. СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ГЕМАГЛЮТИНІНУ І НЕЙРАМІНІДАЗИ РІЗНИХ ШТАМІВПроведено дослідження структурно-функціональних властивостей НА і NA 64 штамів пташиного грипу Н9N2, що викликали епідемію в птахівничих господарствах Ізраіля в 2000-2004 р.р. Досліджено звязок між змінами структури цих білків та деякими їх біологічними властивостями в ході епізоотії, що є важливим для визначення потенційної небезпеки переходу вірусів пташиного грипу Н9N2 до людини. Показано, що в процесі епізоотії константи звязування та швидкості адсорбції вірусу на еритроцитах птахів знижуються, а на клітинах нирок собаки MDCK - зростають. Для достижения этой цели были определены полные нуклеотидные последовательности генов НА и NA ряда штаммов вируса за указанный период времени. На основании изучения первичных структур НА и NA и их генов у исследованных штаммов, а также с привлечением сведений из банка данных по вирусам гриппа птиц и человек, построены филогенетические деревья НА и NA для вирусов Н9N2. Найдено, что “ранние” штаммы ближе по своим свойствам и структуре к референтному вирусу птичьего гриппа Н9N2 (ty/Wisconsin-66), а “поздние” - к вирусам гриппа человека H2N2 (Singapore/57) и H3N2 (Hong Kong/68).На сьогодні, в результаті сезонних міграцій диких птахів, а також завдяки індустріалізації птахівництва та широкому розповсюдженню його продуктів, небезпечний для людей вірус Н5N1 поширився по величезних територіях в Азії, Європі, Америці та на Близькому Сході. Але, зважаючи на постійні еволюційні зміни, що мають місце, цей вірус уособлює сьогодні таку ж потенційну загрозу, як декілька років тому вірус Н5N1. Нарешті, сама можливість переходу віруса грипу від птахів до ссавців, в тому числі й до людини, залежить від характера структурних змін цих білків в ході еволюції віруса. Але особливостям молекулярної еволюції NA i НА та їх генів у віруса Н9N2 до останнього часу приділялось мало уваги порівняльно з вірусом Н5N1. В звязку з тим, що сказано, актуальним є вивчення молекулярних механізмів структурно-функціональної мінливості NA, НА та їх генів, що має місце в процесі еволюції вірусу Н9N2, та спроба повязати їх із здібністю цього вірусу змінювати хазяїна - переходити від птахів до ссавців, зокрема і до людини.Дослідження проведені на 61 штамі вірусу грипу H9N2, що були виділені у птахівничих господарствах Ізраіля в період епізоотії 2000 - 2004 р.р. Референтні штами пташиного {ty/wisconsin-66 - (H9N2)} та людських {Singapore/57 - (H2N2) і Hong Kong/68 (H3N2)} вірусів грипу були люб’язно надані доктором Скехелом [Dr. В разі еритроцитів використовували їхню 15% суспензію та алантоїсну рідину з титром не менш, ніж 1:128 [Rivetz R., Lipkind M., 1985].ступінь адсорбції вірусу оцінювали за зміною титру гемаглютинації в пробах, які відбирали з інтервалами 15 хвилин для клітин MDCK та 2 хвилини-для курячих еритроцитів при 40С. Розраховували час адсорбції 50% вірусу на клітинах (t50% ) , константу ії швидкості (К - тангенс початкового кута нахилу кінетичної кривої адсорбції) та за методом Скетчарда [Dupuis G., Clairoux-Moreau S., 1980] - константу звязування (Кб=[Cv ? Cc] /[Cv] ? [Cc], де [Cv ? Cc] - питомий вміст комплексів клітина-вірус, Cv і Cc - питомий вміст вільних вірусу та клітин відповідно). 1 зображені часові залежності ступеню звязування 6 штамів вірусу грипу H9N2 (включаючи референтний штам ty/wisconsin-66) на культурі клітин собаки MDCK та курячих эритроцитах, а в табл.1 наведені розраховані згідно з цими кривими константи швидкості, часи адсорбції 50% вірусу на різних клітинах та константи звязування його з різними клітинами. Як бачимо, хоча в рецептор-звязуваючому сайті частоти зустрічальності Ала в позиції 190 і Лей в позиції 226 вищі частот зустрічальності Глу і Глн в цих позиціях, обидві заміни досить рівномірно розсіяні по дослідженим штамам вірусу і не мають регулярного характеру на протязі епізоотії.Проведено дослідження молекулярної еволюції НА та NA 64 штамів пташиного грипу Н9N2, що спричинили епізоотію в Ізраілі в 2000 - 2004 р.р. Знайдено кореляцію між змінами первинної структури та функціональними властивостями обох білків Побудовано еволюційні дерева, що уточнили положення вивчених штамів в систематиці вірусів грипу Н9N2. Визначені повні нуклеотидні послідовності гена НА 6-ти штамів та області гена, що кодують ланки розщеплення, рецепторзвязуючий та антигенний сайти інших штамів, а також нуклеотидні області гену NA, які кодують амінокислотні залишки в активному центрі та центрі звязування вивчених штамів вірусу Н9N2. Показано, що в процесі епізоотії константи звязування та швидкості адсорбції вірусу на еритроцитах птахів знижуються, а на клітинах нирок собаки MDCK - зростають; часи 50%-ої адсорбції поводять себе протилежним чином. В процесі епізоотії температурний оптимум ферментативної активності NA вивчених штамів вірусу грипу Н9N2 зсувається від 420 С до 370С , а константа Міхаеліса стає меншою при 370 С, ніж при 420 С.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ