Структурно-функціональні властивості червоного флуоресцентного білка tagrfp657 та його застосування у клітинній біології - Автореферат

Харківський національний університет імені В.Н. Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наукКиїв, завідувач лабораторії сигнальних механізмів клітини, доктор біологічних наук, професор Ушакова Галина Олександрівна, Дніпропетровський національний університет імені Олеся Гончара МОН України, професор кафедри біофізики і біохімії. Методами молекулярного клонування, на основі КДНК ФБ MKATE з довжиною хвилі флуоресценції 635 нм був створений білок TAGRFP657 з флуоресценцією понад 650 нм. Ароматичні АК у мікрооточенні хромофора (69His, 148His, 181Phe та 203Tyr) утворюють систему ?-? стекінгових взаємодій з фенольним та імідозольним кільцями хромофора, що супроводжується зниженням енергії збудженого стану, і, як наслідок, збільшенням довжини хвилі максимумів збудження та флуоресценції. Встановлено звязок структури TAGRFP657 з його флуоресцентними та біохімічними властивостями. Максимуми збудження та флуоресценції TAGRFP657становлять 611 нм та 657 нм, відповідно.Встановлено, що практично кожний білок у живій клітині можна помітити за допомогою GFP, якщо закодувати його послідовність в одній рамці зчитування з цим білком. На сьогодні, найбільший інтерес, з точки зору практичного застосування, привертають червоні ФБ з довжиною хвилі флуоресценції понад 630 нм, завдяки їх здатності підвищувати рівень детекції флуоресценції. Беручи до уваги гостру необхідність подальшого розвитку методів візуалізації біологічних обєктів для зясування фундаментальних основ життєдіяльності клітин за умов норми та патологій різного генезу, створення нових варіантів флуоресцентних білків з довжиною хвилі флуоресценції в діапазоні 650-670 нм є актуальним завданням, що має велике теоретичне та практичнее значення. Метою роботи було створення на основі гена ФБ MKATE нового червоного ФБ з довжиною хвилі флуоресценції від 650 нм до 670 нм та зясування звязку особливостей первинної структури нового білка з його довгохвильовими спектральними властивостями і фотохімічними характеристиками, а також оцінка можливості практичного застосування нового червоного ФБ у живих клітинах та як флуоресцентного маркера у протоковій цитофлуориметрії. Методами молекулярного клонування створити новий червоний ФБ з довжиною хвилі флуоресценції від 650 нм до 670 нм на основі гена мономерного червоного флуоресцентного білка MKATE (довжина хвилі флуоресценції 635 нм).Для створення нових червоних ФБ з довжиною хвилі флуоресценції понад 650 нм використовували ген білка MKATE (максимуми збудження та флуоресценції 588 нм та 635 нм, відповідно). Шляхом чергування послідовних циклів випадкового мутагенезу, проведеного з використанням GENEMORPH II Random Mutagenesis Kit (Stratagene), за умов, що ведуть до 16 мутацій на 1000 пар основ, та сайт-спрямованого мутагенезу з використанням QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) було отримано 3 бібліотеки мутантів (Ho S., 1989). Через 16 годин результати сортування аналізували під флуоресцентним стереомікроскопом Leica MZ16F, обладнаним червоним (збудження 570/30 нм, флуоресценція 615/40 нм) та далеко-червоним (збудження 605/40 нм, флуоресценція 640 нм LP) наборами фільтрів (Chroma). Після сортування на протокових цитофлуориметрах та подальшого відбору колоній та штрихів під флуоресцентним стереомікроскопом, спираючись на найбільше співвідношення далеко-червоної (фільтр 640 LP) до червоної флуоресценції (фільтр 615/30) клонів, були знайдені мутанти з більшою довжиною хвилі флуоресценції. Для створення другої бібліотеки мутантів сайт-спрямованим мутагенезом з використанням праймерів, що перекривались, було відібрано КДНК мутанта № 134 (Lys9Thr; Met44Gln), з максимумами збудження та флуоресценції 590 нм та 648 нм, відповідно.У дисертаційній роботі приведено результати дослідження структурно-функціональних властивостей нового червоного флуоресцентного білка TAGRFP657: амінокислотної послідовності та замін, відповідальних за довгохвильові властивості, швидкість та ефективність дозрівання хромофора, залежність інтенсивності флуоресценції від РН. Методами молекулярного клонування на основі КДНК мономерного червоного ФБ MKATE (довжина хвилі флуоресценції 635 нм) створено новий, найбільш довгохвильовий на даний час, флуоресцентний білок TAGRFP657 з максимумами збудження та флуоресценції 611 нм і 657 нм, відповідно. Введення ароматичних амінокислот до мікрооточення хромофора (69His, 148His, 181Phe та 203Tyr) призводить до утворення системи ?-? стекінгових взаємодій з фенольним та імідозольним ароматичними кільцями хромофора, супроводжується зниженням енергії збудженого стану, і, як наслідок, збільшенням довжини хвилі максимумів збудження та флуоресценції. Продемонстровано звязок структури білка з його флуоресцентними та біохімічними властивостями на прикладі TAGRFP657 та його мутантних форм. Визначено константи швидкостей реакцій формування хромофора, ефективність дозрівання хромофора (по співвідношенню піків абсорбції) та РН-стабільність білків.

2. Основний зміст роботи