Структурно-функціональні особливості кіназ рибосомного білка S6 - S6К1 та S6К2 - Автореферат

Інститут молекулярної біології та генетики АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук Роботу виконано у відділі структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАН України. Окремі дослідження проведено в лабораторії клітинної регуляції Інституту ракових досліджень Людвіга (м.Лондон, Велика Британія). Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН УкраїниАктивація РІ3К/MTOR сигнального шляху починається з активації власне РІЗ кінази, що індукується активованими внаслідок взаємодії з позаклітинними мітогенами рецепторами плазматичної мембрани (Richardson et al., 2004). Активність MTOR кінази залежить не лише від дії мітогенних стимулів, опосередкованих РІ3К, а і від сигналів, індукованих поживними речовинами (амінокислотами, глюкозою, жирними кислотами) (Tee et al., 2005). Доведено, що S6К здатна фосфорилювати in vitro цілу низку додаткових субстратів, а саме: проапоптичний білок BAD (Harada et al., 2001); білок SKAR, що бере участь у сплайсингу МРНК (Richardson et al., 2004); фактор транскрипції CREM (de Groot et al., 1994); субстрат інсулінового рецептора (IRS) (Harrington et al., 2005); фактор ініціації трансляції білкового синтезу 4В (EIF4B) (Raught et al., 2004). Робота відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводяться у відділі структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетною темою №2.2.4.10 - “Дослідження сигнальних шляхів при злоякісній трансформації та пошук пухлиноспецифічних антигенів” (номер державної реєстрації - 0101U000360, 2001-2005 рр.), а також у рамках співробітництва з Інститутом ракових досліджень Людвіга (Лондон, Велика Британія), згідно з договором про наукове співробітництво. Метою дослідження було визначення структурно-функціональних особливостей представників родини кіназ рибосомного білка S6 - S6K1 та S6K2 і зясування відмінностей у рівні їхньої експресії та субклітинній локалізації в нормальних тканинах та пухлинах людини.КДНК фрагмент, що містив 518 п. н. кодуючої ділянки та 130 п. н. кодуючої ділянки КДНК EST клону S6К2 людини (АА 410355); для аналізу МРНК КОА-синтази - 850-п. н. фрагмент (1-850) КДНК КОА-синтази кодуючої ділянки. Аналіз EST бази даних дозволив виявити клон, що містив високогомологічний до ДНК послідовності S6K1 фрагмент КДНК, з використанням якого як зонду було клоновано КДНК білка структурно подібного до S6K1 (Gout et al., 1998), який, можливо, є новою формою кінази рибосомного білка S6 - S6K2. Існування в послідовності S6K2 гомологічних сайтів фосфорилювання, залучених до активації S6K1, передбачає подібні механізми регуляції активності S6K1 і S6K2. Відмінності у структурній організації, що стосуються регуляторних N-та С-кінцевих ділянок, свідчать про існування відмінностей у функціонуванні кіназ у клітині, в першу чергу повязаних із особливостями регуляції їхньої активності, субклітинної локалізації і, можливо, використанням альтернативних субстратів. Вестерн-блот аналіз лізатів клітин до та після стимуляції клітин сироваткою за допомогою анти-ЕЕ свідчить, що активація обох форм кіназ супроводжується зниженням електрофоретичної рухливості рекомбінантних білків (рис.(Автором модифіковано методику отримання моноклональних антитіл, підготовлено статтю до друку). (Автором клоновано КДНК С-кінцевого фрагменту S6K1 у відповідний вектор, рекомбінантний пептид експресовано у клітинах бактерій, проведено його очищення та подальшу імунізацію тварин, охарактеризовано моноклональні антитіла, підготовлено статтю до друку). (За участі автора сформульовано завдання дослідження, проведено очистку Кі67 антигену, підготовлено статтю до друку). (Автором проведено клонування S6K1 i S6K2 у вектори для експресії в клітинах ссавців, визначено активність S6K, підготовлено статтю до друку). (За участі автора сплановано завдання дослідження, проаналізовано КДНК бібліотеку мишей з використанням “bait” конструкцій S6K1, проведено ідентифікацію позитивних клонів, отримано антитіла до КОА-синтази, визначено рівень експресії КОА-синтази в різних тканинах щура, проведено мутаційний аналіз).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ