Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные белки - Автореферат

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные белкиРабота выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей генетики им. Вавилова Российской академии наук Официальные оппоненты: Дейнеко Елена Викторовна доктор биологических наук, профессор, Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория биоинженерии растений, заведующая лабораторией Тимирязева Российской академии наук, лаборатория зимостойкости, научный сотрудник Защита состоится «14 » ноября 2012 года в 16-30 на заседании диссертационного совета Д220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А.В настоящее время трансгенные растения широко используются как модели для изучения фундаментальных исследований по изучению физиологической роли растительных генов и для решения прикладных задач по созданию устойчивых форм сельскохозяйственных культур, а также для продукции рекомбинантных белков в растениях. Эффективность экспрессии трансгена обуславливается рядом факторов: кодоновым составом трансгена; регуляторными элементами, контролирующими его экспрессию; интеграцией трансгена в определенные участки генома растений и рядом других. Сейчас, помимо стабильной экспрессии целевых генов исследователями широко используется транзиентная экспрессия этих генов как эффективный подход для изучения регуляторных элементов и физиологической роли генов растений, а также для использования растений как продуцентов целевых белков. Для преодоления эффекта «замолкания» трансгена исследователи используют подход, основанный на ко-трансформации растений вектором, несущий ген белка р19 вируса томатов, супрессор посттранскрипционного замолкания генов. Следует подчеркнуть, что решение важных научных и прикладных задач с использованием экспрессии гетерологичных генов в растениях затруднено, прежде всего, за счет значительных пробелов в понимании генетических детерминант, которые обуславливают эффективную экспрессию гетерологичных генов в растениях.В обзоре литературы приведены современные данные о подходах к экспрессии гетерологичных генов в растениях, а также проведен анализ особенностей растительных экспрессионных векторов. Особое внимание уделено исследованию генетических детерминант, обуславливающих высокую экспрессию перенесенного гена (трансгена) на разных уровнях: транскрипция, трансляция, стабильность белка. В работе использованы стандартные процедуры молекулярного клонирования, которые выполнялись согласно методическому руководству Sambrook et al. В работе использовали растения табака Nicotiana benthamiana и Nicotiana excelsior, выращенные до 6 недельного возраста. Анализ полученных растений после агроинфильтрации проводили на четвертые сутки путем выделения суммарного растворимого белка из листьев путем растирания свежей или замороженной растительной ткани в жидком азоте в 50 ММ Tris-HCL (PH=8.0) буфере.Для этого проведен сравнительный анализ данных по уровню экспрессии генов Arabidopsis и данные о генах этого растения. Проведенный анализ позволил выявить следующие закономерности: у 68,4% и 67,6% генов с уровнем относительной экспрессии от 51 до 100 и от 101 и выше, соответственно, в положении - 3 встречается нуклеотид А, а в положении 4 - нуклеотид G (с частотой от 0,6 и до 0,9); у 1,4% генов с уровнем относительной экспрессии от 0 до 51 в положении-3 встречается нуклеотид А, а в положении 4 - нуклеотид G (с частотой от 0,6 и до 0,9). Таким образом, проведенный поиск нуклеотидных последовательностей, которые могут позитивно влиять на уровень транскрипции, трансляции и стабильности целевых белков в растениях с использованием биоинформационного анализа созданной базы данных и анализа литературы позволяет сделать следующие заключения: 5’-область гена AT1G67090, имеющего наивысший уровень экспрессии в растении в целом, и в листьях, в частности, может быть использована как регуляторный элемент, позитивно влияющий на уровень транскрипции гетерологичных генов в растениях; промоторы вирусов могут быть тестированы в качестве потенциальных регуляторных элементов, способных в значительной степени увеличить уровень транскрипции целевых генов в растениях; GC-богатые области, ассоциированные с генами растений, характеризующимися высоким уровнем экспрессии, могут быть потенциальными регуляторными элементами, позитивно влияющими на уровень транскрипции гетерологичных генов в растениях; нуклеотид А в-3 и нуклеотид G в 4 положениях из окружения инициирующего кодона могут играть ключевую роль в увеличении эффективности трансляции генов растений; свойства второго кодона в последовательности белка могут в значительной степени повлиять на стабильность белкового продукта в растениях.

2. Основное содержание работы