Создание РНК-аптамеров, способных связываться с аутоантителами, вырабатываемыми организмом человека при рассеянном склерозе - Дипломная работа

1. Аптамеры к белковым мишеням: методы отбора, свойства и применение (обзор литературы) 1.1 Метод SELEX 1.2 Получение оцДНК- и РНК-аптамеров 1.3 Модификация аптамеров 1.4 Анализ структуры аптамеров 1.5 Применение аптамеров 1.5.1 Аптамеры в качестве средств детекции белков 1.5.2 Аптамеры в качестве терапевтических средств 2. Экспериментальная часть 2.1 Исходные материалы 2.2 Основные методы работы 2.3 Методики эксперимента 2.3.1 Твердофазный фосфитамидный синтез комбинаторной библиотеки олигодезоксирибонуклеотидов 2.3.2 Деблокирование олигодезоксирибонуклеотидов 2.3.3 Выделение олигодезоксирибонуклеотидов 2.3.4 Получение 2-F-модифицированной РНК-библиотеки 2.3.5 Амплификация 2-F-модифицированной РНК-библиотеки 2.3.6 SELEX, один раунд 2.3.7 “Негативный” SELEX 2.3.8 Введение радиоактивной метки по 5-концу 2-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки 2.3.9 Определение констант диссоциации комплексов 2-F-модифицированной РНК-библиотеки с поликлональными аутоантителами 2.3.10 Хроматографическое разделение 2-F-модифицированной РНК-библиотеки после 10-го раунда SELEX по сродству к поликлональным аутоантителам 2.3.11 Получение плазмидной ДНК на основе вектора pUC18 и дцДНК-библиотеки фракций I, II и III 2.3.12 Приготовление компетентных клеток 2.3.13 Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК 2.3.14 Определение наличия дцДНК-библиотеки в плазмидной ДНК трансформированных клеток 2.3.15 Выделение плазмидной ДНК 2.3.16 Определение наличия дцДНК-библиотеки в полученных плазмидных ДНК 2.3.17 Определение нуклеотидной последовательности плазмидных ДНК 2.3.18 Поиск гомологичных участков РНК-клонов фракций I, II и III 48 2.3.19 Компьютерное моделирование вторичной структуры РНК-клонов фракций I, II и III 3. оптическая единица НК - нуклеиновая кислота ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК - кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота дцДНК - двуцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота оцДНК - одноцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота АТ - антитела IgG - иммуноглобулины класса G ОБМ - основный белок миелина ВИЧ - вирус иммунодефицита человека AMV - вирус птичьего миелобластоза РС - рассеянный склероз е. а. единица активности LNA - конформационно затрудненная нуклеиновая кислота ATP - аденозинтрифосфат GTP - гуанозинтрифосфат CTP - цитидинтрифосфат UTP - уридинтрифосфат 2-F-UTP - 2-F-уридинтрифосфат 2-F-СTP - 2-F-цитидинтрифосфат dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат ?-[32P]-ATP - ?-[32P]-аденозинтрифосфат N-MeIm - N-метилимидазол IPTG - изопропилтиогалактозид X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-?-D-галактопиранозид BSA - бычий сывороточный альбумин DMF - диметилформамид DTT - дитиотреит THF - тетрагидрофуран Py - пиридин DCA - дихлоруксусная кислота NTA - нитрилтрехуксусная кислота (2-[бис(карбоксиметил)амино]уксусная кислота) CPG - стекло с контролируемым размером пор ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией УФ - ультрафиолет EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота Tрис - трис(оксиметил)аминометан SELEX - systematic evolution of ligands by exponential enrichment (систематическая эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении) Kd - константа диссоциации ПЛУ - полилинкерный участок Введение Аптамеры (от лат. aptus - подходящий, греч. meros - звено) - синтетические однонитевые нуклеиновые кислоты или пептиды, способные связывать свои молекулы-мишени с высокой аффинностью и специфичностью [1-3]. Рассеянный склероз - тяжелое хроническое аутоиммунное заболевание центральной нервной системы с непредсказуемым, часто прогрессирующим течением [27]. Работа выполнялась совместно с Лабораторией ферментов репарации и Группой взаимодействий биополимеров ИХБФМ СО РАН. Образовавшиеся комплексы отделяют от несвязавшихся молекул, разрушают и амплифицируют связавшиеся с мишенью олигонуклеотиды, получая обогащенную библиотеку. Рис. 2. Все способы отделения комплексов от несвязавшихся молекул можно разделить на две группы. I. Методы, основанные на иммобилизации белка-мишени: 1. ковалентная иммобилизация (белок ковалентно связывают с аффинным сорбентом, например, N-гидроксисукцинимид-активированной сефарозой [40], Ni-NTA аффинной смолой [48, 49] и др.); 2. нековалентная иммобилизация (белок иммобилизуют за счет сил адсорбции на ПЦР-пробирке [16, 50], гидрофобных парамагнитных шариках [36, 51, 52], магнитных шариках [36, 47, 53], нитроцеллюлозе [5, 54-57], стрептавидиновых “шариках” в случае биотинилированных белков-мишеней [58], модифицированной сефарозе [18, 59]. В случае использования магнитных шариков для разделения комплексов и несвязавшихся молекул применяют магнитное поле. II. Наиболее приемлемым из всех способов отделения комплексов белков-мишеней с комбинаторной библиотекой от несвязавшихся молекул является нековалентная иммобилизация. В случае получения РНК-аптамеров синтезированную комбинаторную ДНК-библиотеку переводят в дцДНК-форму с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli и 5-праймера для ам