Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза - Диссертация

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ БСА - бычий сывороточный альбумин КББ - карбонат-бикарбонатный буфер КИФА - количественный иммунофлуоресцентный анализ МИБП - медицинские иммунобиологические препараты мин - минутаАнализ сложившейся эпидемиологической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулезом в нашей стране носит характер эпидемии (Онищенко Г.Г., 2002; Пунга В.В., Капков Л.П., 1999). По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) в промежутке времени с 2000 по 2020 гг. туберкулезом в мире заболеют около 200 млн. человек, умрут около 35 млн. человек, будут инфицированы приблизительно 1 млрд. человек (WHO Fact Sheet, 2000). Основные задачи исследования: - отработать методические подходы по извлечению полноценных антигенных комплексов из микробных биомасс возбудителя туберкулеза и получить высокоактивные иммунные туберкулезные сыворотки; Разработаны приемы по предварительному селективному концентрированию микобактерий туберкулеза и их антигенов на магноиммуносорбентах (МИС) с последующим проведением экспрессных методов (ИФА, КИФА), позволяющие исследовать объекты внешней среды, материал от больных людей или животных, в том числе и сильно загрязненные, неограниченного объема пробы с низкой концентрацией микобактерий с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей общепринятые экспрессные методы. Основная теоретическая значимость проделанной работы заключается в определении научно-методических аспектов разработки иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулеза, которые учитывают характерные особенности антигенной структуры микобактерий, свойства матриц биотической (липиды) и абиотической (органокремнеземы, латексы) природы, методы конъюгации лигандов и маркеров, определяя направления последовательных стадий и операций биотехнологии производства диагностических туберкулезных препаратов.К первой группе отнесен туберкулез наряду с такими заболеваниями как гепатит В, С, СПИД и некоторые другие (Алексеев П., 2004). В целях законодательного регулирования мероприятий по борьбе с инфекционными заболеваниями в 2001 г. принят Федеральный закон «О предупреждении распространения туберкулеза в РФ». В соответствии с данными ООН, 1/3 населения инфицирована МТБ (микобактериями туберкулеза), каждый год выявляется 8 млн. случаев активного туберкулезного (ТБ) процесса, ведущего к смертности 3 млн. человек (Dolin PJ, Raviglione MC, Kochi Наблюдаемое в настоящее время в РФ прогрессирование заболеваемости туберкулезом связано с очевидным снижением уровня жизни человека и сопутствующим дисбалансом в питании; многочисленными стрессами и наплывом беженцев из других республик бывшего СССР (их заболеваемость туберкулезом достигает 700 случаев на 100 000 населения), особенно чеченских беженцев (Jakubowiak W., Komourzaeyev В., Dara M. et. al. Зависимость заболевания туберкулезом от социальных факторов обусловлена усилением миграции с территорий, неблагополучных по туберкулезу, снижением уровня жизни и ухудшением питания населения (в основном неработающей части населения), демографическими сдвигами в сторону старения населения (Покровский В.И., Позднеев О.И. М.,1998; Белиловский Е.М., Борисов С.Е., Дергачев А.В. с соавт., 2003).На приоритетном месте медицинской биотехнологии стоят вопросы разработки и совершенствования технологий изготовления биопрепаратов с целью повышения их активности, чувствительности, специфичности, экспрессности при диагностике туберкулеза у больных людей и выявлении возбудителя в объектах внешней среды. Такие иммуносорбенты обладают прочной ковалентной связью антигена с матрицей и получаются при взаимодействии реакционноспособных функциональных групп биополимеров со специально подобранными бифункциональными соединениями. Попытки истощения сывороток при использовании в качестве адсорбентов микробных клеток, широко применяемых в сывороточном производстве (Карпов С.П. с соавт.,1976; Смирнов В.В. с соавт., 1980; Пекшев А.В., Елагин Г.Д., Пятков В.А., 1998), приводят к существенной потере специфической активности нативных сывороток, при их частичном насыщении антигенным материалом. Метод их выделения с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) является эффективным, так как ПЭГ хорошо осаждает белки, обладает селективностью, более специфичен при осаждении белков различной природы, чем сульфат аммония. Особое распространение получили методы, основанные на применении антител, меченных специальными маркерами-флуорохромами, которые позволяют с помощью люминесцентного микроскопа проводить высокочувствительные определения исследуемого вещества в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) (CoonsОднако, наряду со всеми положительными сторонами данной матрицы, следует отметить недостаточную стабильность связи между лигандом и BRCN-активированной агарозой (Turkova J., 1978), низкую механическую стабильность сорбентов, что ограничивает возможности их практического использования. хитина (Бендекене В.Г. с соавт.