Скринінг мікробних продуцентів, очистка та біоаналітичне використання L-лактат:цитохром c-оксидоредуктази Hansenula polymorpha - Автореферат

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИРоботу виконано в Інституті біології клітини НАН України. Інститут біології клітини НАН України, завідувач відділу аналітичної біотехнології. Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Дзядевич Сергій Вікторович Інститут біології клітини НАН України, провідний науковий співробітник відділу молекулярної генетики та біотехнології. Захист відбудеться “14“ вересня 2007 р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д35.246.01 в Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м.Засвоєння молочної кислоти пекарськими дріжджами Saccharomyces cerevisiae здійснюється через селективне окислення L-і D-лактату, яке каталізується мітохондріальною L-лактат:ферицитохром с-оксидоредуктазою (КФ 1.1.2.3; флавоцитохром b2, ФЦ b2) і D-лактат:ферицитохром с-оксидоредуктазою (КФ 1.1.2.4). Флавоцитохром b2 завдяки своїм унікальним каталітичним властивостям (абсолютна специфічність до L-лактату, відсутність у потребі екзогенного кофактора) може мати важливе біоаналітичне значення, оскільки може замінити NAD -залежну лактатдегідрогеназу (ЛДГ) мязів ссавців або бактерійну лактатоксидазу (ЛО) при визначенні вмісту L-лактату в біологічних рідинах та харчових продуктах за допомогою ензиматичних та біосенсорних підходів. Дисертаційна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу і виконувалась у рамках бюджетних тем: “Біотехнологічне отримання та функціональна характеристика білків, важливих для діагностики та лікування“ (№ держреєстрації 0102U000614), “Створення нових біоаналітичних систем на основі оксидоредуктаз” (№ держреєстрації 0106U002598) та проекту “Конструювання ферментних елементів біосенсорів на основі оксидоредуктаз для контролю вмісту лактату і етанолу в біологічних рідинах та бродильних культурах” (№ держреєстрації 0103U004741) комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження в галузі сенсорних систем та технологій”. 05-109-5207 “Construction of flavocytochrome b2-overproducing strain by the use of CYB2 gene-containing expression cassette, bioanalytical application of the recombinant enzyme as a bioselective element of an analytical kit and amperometric sensor”; FEMS-2006 (І) “Application of cells of methylotrophic yeast Halsenua polymorpha and enzyme from this source for development of new L-lactate selective bioanalytical approaches” та West-Ukrainian BIOMEDICAL Research Center (WUBMRC-2006) “Development of a novel L-lactate selective enzymatic kit based on flavocytochrome b2 from methylotrophic yeast Hanlsenua polymorpha and its biomedical testing”. Метою роботи був пошук мікробних продуцентів стабільної форми ФЦ b2 та створення на основі цього ферменту нових ензиматичних і біосенсорних методів аналізу L-лактату.У результаті експериментальних досліджень проведено скринінг дріжджових продуцентів флавоцитохрому b2, виділено та охарактеризовано фермент із клітин найперспективнішого продуцента, встановлено деякі його фізико-хімічні властивості, створено нові ензиматичні та біосенсорні аналітичні підходи визначення L-лактату з використанням цього ферменту. Показано, що метилотрофні дріжджі H. polymorpha, нездатні до росту на лактаті як єдиному джерелі вуглецю та енергії, мають високий рівень активності флавоцитохрому b2 (до 0,7 мкмоль·хв-1 на 1 мг білку безклітинного екстракту). При вирощуванні H. polymorpha у середовищі з глюкозою та лактатом спостерігається діауксія, причому, лактат засвоюється після вичерпання глюкози. Завдяки використанню двоетапної схеми електроосадження ферменту і опосередкування електронного перенесення через осмій-вмісний редокс-полімер, біосенсори характеризуються високою селективністю та чутливістю до L-лактату, хорошою операційною стабільністю. (Дисертант провів скринінг низки дріжджів за здатністю підвищеної стабільності флавоцитохрому b2 та дослідив регуляцію синтезу ферменту).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ