Сиалидазная активность и морфологические изменения опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения - Автореферат

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Работа выполнена во ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. Научный консультант доктор медицинских наук профессор Петр Дмитриевич Шабанов Официальные оппоненты доктор медицинских наук профессор Сергей Викторович Чепур доктор медицинских наук Дмитрий Эдуардович Коржевский доктор медицинских наук Ирина Алексеевна Одинцова Защита состоится “”марта 2009 г. в 11.00 часов на заседании специализированного ученого совета Д 001.022.02 по защите кандидатских и докторских диссертаций при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад.Изменение морфологических свойств клетки в ответ на воздействие внешних и/или внутренних факторов характеризует ее состояние. Ганглиозиды, являясь неотъемлемой составной частью плазматической мембраны любой эукариотической клетки, подвергаются гидролизу ферментом сиалидазой, элиминирующим молекулы сиаловой кислоты из их структуры. К настоящему времени уже не вызывает сомнения, что сиалидазы играют важную роль в изменении морфологических свойств клеток. Показано, что накопление сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в области окончания одного из отростков способствует его росту (Rodriguez et al., 2001). Матричная рибонуклеиновая кислота, с которой происходит трансляция фермента сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной, выявляется в коре головного мозга, мозжечке и гиппокампе у мышей.Клеточная линия NB-1 нейробластомы человека (нейральная клеточная линия) выращивалась и поддерживалась в РПМИ-1640 (45%) и среде Игла (45%), содержащей 10%-ю эмбриональную телячью сыворотку на чашках Петри (диаметр 10 см), покрытых поли-Л-лизином (рис. В эксперименте клеточная линия инкубировалась в течение 24 и 48 ч без эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением или без дб-ЦАМФ (2 ММ) и по окончании инкубации клетки собирались для биохимического анализа. Не менее 600 клеток на предмет исследования длины отростков были выбраны для анализа в поле фазово-контрастного микроскопа. Нейральные клетки с отростками были подразделены на 4 группы: 1) клетки с ультракороткими отростками (до 12 мкм); 2) клетки с короткими отростками (длина отростка 12-24 мкм); 3) клетки с отростками средней длины (длина отростка 25-36 мкм); 4) клети с длинными отростками (длина отростка более 36 мкм). Полученную взвесь фильтровали через стерильную нейлоновую ткань, осаждали клетки из суспензии с помощью центрифугирования (1000 об/мин, 10 мин).При анализе нарушений морфологии ядер в опухолевых клетках отмечено, что циклофосфан, вызывал нарушения в ядрах клеток рабдомиосаркомы РА-23, выражавшиеся, прежде всего, в увеличении частоты клеток с микроядрами и “хвостатыми” ядрами (рис. 1, активность лизосомальной сиалидазы в клонах с низким метастатическим потенциалом варьировала в грубой фракции (фракция I) от 0.903 до 1.297 ед. на мг белка и в среднем составляла 1.100±0.284 ед. на мг белка. Активность лизосомальной сиалидазы в клонах с высокой способностью к метастазированию в грубой фракции (фракция I) варьировала от 0.602 до 0.950 ед. на мг белка и в среднем составила 0.818±0.271 ед. на мг белка, что достоверно не отличалось от среднего показателя, выявленного во фракции I, полученной из клонов с низким метастатическим потенциалом (p>0.05). Дальнейшее исследование обогащенной фракции (фракция II), выделенной из клонов с высоким метастатическим потенциалом, выявило, что средний показатель активности лизосомальной сиалидазы составил 1.48±0.12 ед. на мг белка, тогда как активность лизосомальной сиалидазы, зарегистрированная во фракции II, выделенной из клонов с высоким метастатическим потенциалом, в среднем составляла 2.70±0.29 ед. на мг белка, что значимо отличалось от среднего показателя (фракция II) среди клонов с пониженной способностью к метастазированию (p<0.01). 2), что в клонах с повышенной способностью к метастазированию (высоким метастатическим потенциалом) и в клонах с пониженной способностью к метастазированию активность САПМ различалась и среди выборки клонов D1, D2 и D3 была выше (1.040±0.187 ед. на мг белка) по сравнению со средним показателем, зарегистрированным для выборки клонов С1, С2 и С3 (0.930±0.167 ед. на мг белка).Клоны клеток перевиваемой рабдомиосаркомы РА-23 крыс с высоким метастатическим потенциалом характеризуются низкой активностью лизосомальной сиалидазы, тогда как клоны клеток с низким метастатическим потенциалом характеризуются высокой активностью лизосомальной сиалидазы, что свидетельствует о важности этого фермента для метастазирования опухолевых клеток мышечного происхождения. Циклический аденозинмонофосфат повышает количество матричной РНК гена сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной и ее активность в нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека, что свидетельствует о зависимости этих изменений от ЦАМФ-сопряженной сигнальной системы.