Розробка тест-системи на основі імуноферментного аналізу для визначення антитіл проти вірусу сказу у сироватці крові тварин - Автореферат

РОЗРОБКА ТЕСТ-СИСТЕМИ НА ОСНОВІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ АНТИТІЛ ПРОТИ ВІРУСУ СКАЗУ У СИРОВАТЦІ КРОВІ ТВАРИНАВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук Науковий керівник доктор ветеринарних наук, професор Скибіцький Володимир Гурійович, Національний аграрний університет, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор Буряк Євген Іванович, Одеський державний аграрний університет, завідувач кафедри мікробіології та вірусології кандидат ветеринарних наук, доцент Постой Віктор Петрович, Національний аграрний університет, в. о. завідувача кафедри епізоотології та інфекційних хвороб Захист дисертації відбудеться “15” червня 2004 р. о 10 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м.Дослідження рівня гуморального імунітету дозволяє контролювати, прогнозувати ситуацію щодо сказу та визначати ефективність антирабічної вакцинації тварин (Childs James E., 2000, Недосєков В.В., 2001). Нині в Україні для виявлення антитіл проти вірусу сказу користуються лише методом віруснейтралізації на білих мишах. В Україні не розроблено жодної тест-системи на основі ІФА, яка б дозволяла здійснювати серологічний скринінг рабічної інфекції, визначати рівень гуморального імунітету у тварин, що імунізовані проти сказу. Автором дисертації виконувалась робота у напрямку розробки засобів на основі ІФА для визначення антитіл проти вірусу сказу у сироватці крові тварин. Поставлені в роботі наукові завдання вирішувались експериментально з використанням вірусологічних (культивування вірусу сказу, штам "Щелково-51К" у клітинних культурах ВНК 21/17 та НГУК-1), імунологічних (отримання антирабічної сироватки на кролях; активність отриманих сироваток визначали за методом Atanasiu (1978) та непрямим методом ІФА з використанням конюгату проти імуноглобулінів кроля), гематологічних (визначення кількості еритроцитів, лейкоцитів пробірковим методом з підрахунком в камері з сіткою Горяєва), біохімічних (визначення концентрації загального білка біуретовим методом (2000), білкових фракцій турбодиметричним методом (1991)), імунохімічних (конюгацію рекомбінантного білка А Staphylococcus aureus проводили перйодатним методом, модифікованим Wilson et Nakane (1978); чистоту отриманого конюгату та рабічних антигенів перевіряли за допомогою електрофорезу (1985)), та статистичних (MS Excel для обробки цифрових даних з метою визначення достовірності змін показників та коефіцієнта корелятивних взаємозвязків) методів досліджень.У роботі були використані клітинні культури НГУК-1 та ВНК-21/17, вірус сказу (штами “Щелково-51 К”, ”Внуково-32”, “CVS” та “Овечий” ВДНКІ), а також тварини: 38 кролів породи шиншила масою тіла 1,5-2,0 кг віком 5-8 міс.; 3 000 білих нелінійних мишей масою тіла 9,0-12,0 г та дві вівці масою тіла 50 кг віком 8 міс. Для отримання культурального рабічного антигену використовували вакцинний штам ”Щелково-51 К” вірусу сказу, який культивували у клітинних культурах ВНК-21/17 та НГУК-1 у ролерних умовах. Клітинну культуру із сформованим моношаром клітин заражали вірусом сказу (0,1-0,01 ЛД50/ клітину) та інкубували у ролерних умовах (1-2 об/хв). Вірус інактивували за допомогою гідроксиламіну (Sigma), додаючи його до вірусовмісної суспензії у концентрації 0,01 % та витримуючи в умовах кімнатної температури (18-20 ОС) протягом 24 годин. Концентрування вірусовмісного рабічного матеріалу (культуральні рідини, що містили штами “Щелково-51К” і штами ”Внуково-32” та суспензія мозку, що містила штам “Щелково-51К”) з інфекційним титром вірусу сказу не нижче 106,0 ЛД50/0,03см3 здійснювали за допомогою поліетиленіміну.Оптимальним живильним середовищем для КК НГУК-1 виявилось комбіноване середовище: гідролізат лактоальбуміну з додаванням 10 % середовища 199 та 10 % сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ), 50 мкг/см3 гентаміціну сульфату (РН 7,2-7,4), а також середовище DMEM з 10% сироватки великої рогатої худоби та додаванням аналогічної кількості антибіотику при 37 ОС. Невибагливість до поживних середовищ дозволяла використовувати різні субстрати, але найкраще КК росла на середовищі: суміш ГЛА/RPMI (3/1) з вмістом 10 % сироватки ВРХ. Активність отриманого конюгату порівнювали з активністю комерційного конюгату імуноферментного на основі білка А, поміченого пероксидазою хрону, виробництва інституту Пастера, Санкт-Петербург. Титр конюгату визначали шляхом послідовних розведень до кінцевої точки прояву кольорової реакції у системі виявлення антитіл до білків вірусу гепатиту В людини. Негативними контролями були лунки, вкриті сироваткою крові кролів, вільною від антитіл проти вірусу сказу (ОЩ-).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ