Розробка систем генетичної трансформації для флавіногенних дріжджів Pichia guilliermondii та Candida famata - Автореферат

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИРоботу виконано у відділах регуляції клітинного синтезу низькомолекулярних сполук та біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. Захист відбудеться "12" червня 2001 року о 1000 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеках Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ та Інституту біології клітини НАНУ. У дисертації подано результати роботи зі створення трансформаційних систем вектор-господар для флавіногенних дріжджів P. guilliermondii та C. famata. біосинтез дріжджі флавіногенний ген Декілька штамів P. guilliermondii і C. famata з блокованою ГТФ-циклогідролазою (rib1) або РФ-синтазою (rib7), а також мутантів C. famata з пошкодженою b-ізопропілмалатдегідрогеназою (leu2) відібрано як реципієнтні для трансформаційних систем вектор-господар.На сьогоднішній день досягнуто значних успіхів у вивченні шляху біосинтезу рибофлавіну та його регуляції у флавіногенних дріжджів (Sibirny, 1996). Для подальшого дослідження молекулярних механізмів регуляції флавіногенезу у цих мікроорганізмів і конструювання надпродуцентів рибофлавіну (РФ), важливе значення має застосування методів роботи з рекомбінантною ДНК. Система генетичної трансформації (або трансформаційна система вектор-господар) передбачає наявність “господаря” - реципієнтного штаму мікроорганізму і “вектора” - засобу введення та експресії певного спадкового матеріалу. Таким чином, розробка ефективних систем генетичної трансформації для цих мікроорганізмів дасть змогу інтенсивно досліджувати різноманітні аспекти метаболізму (флавіногенезу зокрема) на молекулярно-генетичному рівні. Метою даної роботи була розробка систем генетичної трансформації для флавіногенних дріжджів P.guilliermondii і C.famata.Плазміда p19R1 містить фрагмент хромосомної ДНК P. guilliermondii (величиною 2,1 тисяч пар нуклеотидів (т.п.н.)), що несе ген RIB1, клонований у PUC19. Було показано, що при трансформації літієвим методом мутанта RG21 плазмідою p19R1 частота трансформації є в 125 разів вищою порівняно з трансформацією мутанта RG162 плазмідою p19R7. При застосуванні сферопластування результати трансформації були такими - для RG21 (плазміда р19R1) - 1,5х104 транс./мкг ДНК, для RG162 (плазміда p19R7) - лише 50 транс./мкг ДНК. Якщо у плазміду p19R7 (несе ген RIB7) ввести фрагмент ДНК P. guilliermondii з геном RIB1 (див. плазміди p19R7R1-1 i p19R7R1-5; рис. Одержані результати свідчать на користь того, що фрагмент ДНК P. guilliermondii, який несе ген RIB1 може містити у собі ARS-послідовність (Autonomously Replicating Sequence), оскільки відомо - наявність такої послідовності на плазміді підвищує частоту трансформації дріжджів в 100-100000 разів (Struhl et al.,1979; Cregg and Madden, 1987; Wolf, 1996).В результаті виконаної роботи розроблено системи генетичної трансформації для флавіногенних дріжджів P. guilliermondii і C. famata. Встановлено, що гени RIB1 i RIB7 P. guilliermondii та LEU2 S. cerevisiae можуть бути використані як селективні маркери в системах генетичної трансформації флавіногенних дріжджів P. guilliermondii і C. famata. Оптимізовано методи трансформації флавіногенних дріжджів (сферопластування, електропорацію). На основі розроблених трансформаційних систем клоновано ген біосинтезу РФ дріжджів C. famata, що кодує РФ-синтазу. Плазміди, що містять гени RIB1 і RIB7 дріжджів Pichia guilliermondii // Тези доповідей VI-го зїзду УТГІС ім.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ