РНК-зв’язувальна активність білка оболонки вірусу мозаїки люцерни в тригібридній системі saccharomyces cerevisiae - Автореферат

Національна академія наук України Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наукНауковий керівник - кандидат біологічних наук, доцент Мельничук Максим Дмитрович, завідувач кафедри фізіології рослин, вірусології та біотехнології Національного аграрного університету. Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Матишевська Ольга Павлівна, професор кафедри біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка; доктор біологічних наук, професор Радавський Юрій Леонідович, завідувач відділу структури та функції білків та пептидів Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України. Захист відбудеться “21” червня 2004 р. О 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім.Біохімічні методи, які використовують для виявлення та аналізу РНК-білкових взаємодій, такі як футпринт аналіз, нативний електрофорез РНК-білкових комплексів (EMSA) тощо, дозволяють вивчати ці взаємодії в умовах in vitro. Більш ефективно РНК-білкові взаємодії можна вивчати в умовах in vivo, за допомогою тригібридної системи Saccharomyces cerevisiae, яка дозволяє не тільки аналізувати РНК-звязувальні властивості деяких білків, але також відкриває можливість ідентифікувати нові, що при скринінгу експресуючих КДНК бібліотек взаємодіють зі специфічною РНК-принадою [Bernstein, 2002]. Знання, набуті при вивченні біохімії фітовірусів, використовують для розробки стратегій захисту сільськогосподарських видів рослин від вірусних хвороб [Бойко, 1990]. Взаємодія білку оболонки вірусу мозаїки люцерни (БО ВМЛ) з власною геномною РНК ініціює активацію геному, що спричинює розвиток симптомів захворювання у чутливих рослин. Метою наших досліджень було продемонструвати взаємодію білка оболонки вірусу мозаїки люцерни (БО ВМЛ) з РНК4 в умовах in vivo, за допомогою тригібридної системи Saccharomyces cerevisiae, виявити частину БО, яка звязується з РНК4, та необхідну для цієї взаємодії полярність ланцюга РНК.З метою одержання поліклональних антитіл, специфічних проти білка оболонки ВМЛ, нами було застосовано бактеріальну систему експресії рекомбінантного аналога білка оболонки (РБО ВМЛ), оскільки ми не мали можливості виділити та очистити в достатній кількості для імунізації кролів препарат природного ізоляту ВМЛ. Мембрану фарбували амідо-чорним барвником для візуалізації РБО та маркерів молекулярної маси (рис.4 А), після чого проводили Вестерн-блот аналіз з використанням афінно-очищених антитіл. Як позитивний контроль формування димерів БО ми використовували генетичні конструкції PBCP та PADCP, які кодують гібридний БО ВМЛ дикого типу (штам Leiden425), приєднаний відповідно до ДНК-звязувального та активуючого транскрипцію доменів дріжджового транскрипційного фактору Gal4p [Tenllado and Bol, 2000]. Паралельно ми клонували послідовність БО ВМЛ з мутаціями у вектор РАСТІІ (Clontech) з утворенням генетичної конструкції РАСТСР, яка кодує гібридний БО ВМЛ в єдиній рамці зчитування з активуючим транскрипцію доменом Gal4p (ТАД-БО ВМЛ) (рис.5). Результати тесту показали, що дріжджові колонії, трансформовані парою плазмід PGBCP/РАСТСР після інкубації фільтру на субстратному середовищі з X-Gal (5-бромо-4-хлоро-3-індоліл-?-D тіогалактопіранозід) не змінювали свого забарвлення, в той час як позитивні контрольні клони PBCP/PADCP набували блідо-синього кольору.В бактеріальній системі експресії E. coli одержано рекомбінантний білок оболонки вірусу мозаїки люцерни (ВМЛ). Компютерний аналіз амінокислотної послідовності показав, що цей білок має дві амінокислотні заміни (G119S, та Q159R) і коротший за свій природний аналог на три амінокислотні залишки. Одержано та очищено поліклональні кролячі антитіла проти рекомбінантного білка оболонки ВМЛ, які показали високий рівень специфічності і чутливості в ІФА та Вестерн-блот аналізі.

Основний зміст роботи