Сущность химерных ДНК, их назначение. Особенности методов конструирования рекомбинантных ДНК. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Методы его клонирования, контроль над исследованиями и использованием полученных результатов.
Добавленная в клетку в большом количестве, "копия" играет в данном случае роль "ловушки": если ее много, белок вируса будет связываться преимущественно с ней, а не с РНК вируса, и, в результате этого, ВИЧ перестанет размножаться. Ключевыми в этом определении являются слова "фрагмент ДНК" и "объединение in vitro", что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т.д. Фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием ферментов рестриктаз. Если к 3"-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (DA)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента - олиго (DT)-сегменты примерно такой же длины, то при смешении полученных таким образом фрагментов происходит спаривание за счет образования водородных связей между олиго (DA)-и олиго (DT)-последовательностями (рис. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках; затем проводят радиоавтографию, и те фрагменты, которые содержат радиоактивную метку, оставляют "отпечатки" на рентгеновской пленке.Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки.
Вывод
Генетическая инженерия, а в частности работа с рекомбинантными ДНК на сегодняшний день является важнейшей и наиболее быстро развивающейся составной частью биотехнологии. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств. В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.
Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.
На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.
Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией.
Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.
Список литературы
1. Баурин В.В., Мирошниченко О.И., Захарченко В.И. и др. // Генноинженерные сельскохозяйственные животные, Москва, 1995, с. 154-165.
2. Бондарук В.В., Захарченко В.И., Беляева Р.Х. и др. // Генноинженерные сельскохозяйственные животные, Москва, 1995, с. 138-153.
3. Брем Г., Зиновьева Н., Эрнст Л.К. // С.-х. биология, 1993, № 6, с. 3-27.
4. Брем Г., Кройслих Х., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве // М.: РАСХН, 1995, 326 с.
5. Васильев И.М., Шихов И.Я., Некрасов А.А. и др. // Доклады АН СССР, 1989, № 1, с. 206-209.
6. Гольдман И.Л., Башкеев Е.Д., Гоголевский П.А. и др. // Доклады РАСХН, 1992, № 9-10, с. 25-30.
7. Гольдман И.Л., Разин С.В., Эрнст Л.К. и др. // Биотехнология, 1994, № 2, с. 3-12
8. Ениколопов Г.Н., Захарченко В.И., Гращук М.А. и др. // Доклады АН СССР, 1988, т. 299, № 5, с. 1246-1249.
9. Зеленина И.А., Семенова М.Л., Алимов А.А. и др. // Генетика, 1991, Т. 27, № 12, с. 2182-2186.
14. Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве // Дубровицы, 2000, 128 с.
15. Кузнецова И.В., Кузнецов А.В., Сигаева В.А. и др. // Биотехнология, 1993, т. 11-12, с.2-5.
16. Ларионов О., Добровольский В., Лагутин О. // «Новые направления биотехнологии», Пущино, 1994, 127.
17. Козикова Л.В., Медведев С.Ю., Булла Й. И др. // «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2001, с. 160-161.
18. Колесников В.А., Алимов А.А., Барминцев В.А. и др. // Генетика, 1990; Т. 26, № 12, с. 2122-2126.
19. Колесников В.А., Зеленина И.А., Семенова М.Л. и др. // Онтогенез, Т. 26, № 6, 467-480.
23. Мирошниченко О.И., Захарченко В.И., Прокофьев М.И. и др. // Доклады ВАСХНИЛ, 1988, № 5, с. 31-32.
24. Прокофьев М.И., Ларионов О.А., Мезина М.Н. и др. // «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2001, с. 114-115.
25. Розенкрантц А.А., Ячменев С.В., Соболев А.С. // Доклады АН СССР, 1990, Т. 312, № 2, с. 493-494.
26. Рядчиков В.Г., Солодухина Л.И., Соколов Н.В. и др. // Генноинженерные сельскохозяйственные животные, Москва, 1995, с. 73-84.
27. Савченкова И., Зиновьева Н., Булла Й. и др. // Успехи совр. биологии, 1996, 116 (1), 78-91.
28. Титова В.А., Зиновьева Н.А., Савченкова И.П. и др. // Доклады РАСХН, 2001, № 6, с. 29-31.
29. Чистяков Д.А., Захарченко В.И., Мезина М.Н. и др. // Генноинженерные сельскохозяйственные животные, Москва, 1995, с. 127-137.
30. Шафен Р.А., Зеленина И.А., Семенова М.Л. и др. // Онтогенез, 2000, Т. 31, № 5, с. 388-394.
32. Эрнст Л.К. Проблемы селекции и биотехнологии сельскохозяйственных животных // Москва, 1995, 359 с.
33. Эрнст Л.К. Генная инженерия - важный фактор селекции сельскохозяйственных животных // «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2001, с. 7-18.
34. Эрнст Л.К., Георгиев Г.П., Ениколопов Г.Н. // Вестник с.-х. науки, 1987, № 9, с. 68-73.
