Регуляция экспрессии генов фумаратгидратазы в зеленых листьях кукурузы в условиях гипоксии - Курсовая работа

МИНОБРНАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕВ природе растения могут находиться в условиях пониженного содержания кислорода при переувлажнении или затоплении почв, при сильной загазованности в городах, произрастании в условиях высокогорья. Толерантность может варьироваться от нескольких часов до нескольких дней и даже недель в зависимости от вида, органов, испытывающих недостаток кислорода, этапа развития, а так же внешних условий, таких как температура. ген фумараза кукуруза фермент Они направлены на предотвращение цитоплазматического ацидоза, адекватную реакцию на стресс, обеспечение минимальной энергией для поддержания жизнедеятельности, модификации экспрессии генов и изменении метаболических путей с целью акклиматизации к низкому содержанию кислорода в среде [34].А так же обмен веществ, при котором ограничивается рост с целью сохранения углеводных и энергетических запасов до тех пор, пока кислород не будет снова в свободном доступе [22]. В природных условиях гипоксия может наблюдаться в случае избыточного увлажнения или затопления почв, в связи, с чем растение может длительное время испытывать недостаток кислорода. Для выполнения надлежащих функций митохондрии выработали особую стратегию, с помощью которой даже в условиях гипоксии они сохраняют работоспособность ЭТЦ без кислорода посредством использования нитрита в качестве терминального акцептора электронов. С другой стороны, нитраты могут косвенно поддерживать функциональность митохондрий при гипоксии, через его восстановлением до нитритов, которые могут быть импортированы в митохондриях, подобным переносчика найденному в хлоропластах или с помощью внутреннего митохондриального мембранного анион-канала (PIMAC), активируемого при низкой концентрации АТФ [28]. Концентрация кислорода в клетке влияет на метаболическую активность как животных так и растительных тканей, а также в клетках бактерий и дрожжах[14].В растениях даже небольшое снижение концентрации кислорода в окружающей среде приводит к изменению клеточной энергетики (соотношение АТФ и АДФ), увеличение NADH по отношению к NAD как правило, все это рассматривается как общий ответ на гипоксию аэробных организмов, в том числе и растений [11].Данный фермент в органическом мире представлен двумя основными классами: класс I встречается только у прокариот, а класс II имеет широкое распространение и обнаружен также у эукариот и архебактерий [35]. Более того класс II фумаратгидратазы это группа высококонсервативных последовательностей; митохондриальная форма фермента в цикле трикарбоновых кислот у эукариотических клеток тесным образом связана с а-протеобактериальными гомологами, являясь доказательством того, что гены были заимствованы у митохондриальных симбионтов. Более отдаленное отношение к классу II фумаразы имеют гены E.coli и Corynebacterium, кодирующие аспарат-аммоний-лиазную активность. Фермент представляет собой тетрамер,состоящий из идентичных субъединиц с молекулярной массой 48,5 КДА и который состоит из 466 аминокислотных остатков. Второй сайт (сайт В), является как бы соседним и создан остатками, принадлежащими отдельной субъединице (b-субъединицы), то есть Ар-126, Гис-129, Асн-131, и Асп-132.Затем помещали в стаканчики с чистой водой и ставили на 24 часа в изолированные от поступления света вакуум-эксикаторы объемом 5 литров, через которые пропускались различные газовые среды - воздух, углекислый газ и азот из коммерческих баллонов. Активность фумаратгидротазы определяли спектрофотометрическим методом на СФ 2000 при длине волны 240 нм. по увеличению оптической плотности в следствии образования двойной связи в молекуле фумарата.В качестве субстрата использовался малат натрия. Растительную навеску массой 150-200 мг растирали в ступке в соотношении 1:5 с 0,05М. фосфатным буфером PH 7.4, содержащим 5ММ ЭДТА и 5ММ MGSO4 смесь фильтровали и центрифугировали 5 мин , 5000 об/мин на ЦФ eppendorf Centrifuge 5804 R. В кварцевую кювету вносили 3 мл. среды спекстрофотометрирования, вносили 10 мкл. пробы и определяли изменение оптической плотности при длине волны 240 нм. Активность фермента рассчитывали по формуле: где ?D - изменение оптической плотности при длине волны 240 нм, ? - коэффициент молярной экстинкции, Vобщ - общий объем ферментной вытяжки (мл), Vвнес - объем внесения (мл), t - время (мин).Способность растений произрастать в обедненной кислородом среде связана с формированием целого комплекса анатомо-морфологических и физиолого-биохимических приспособлений, среди последних ведущая роль принадлежит приспособлениям процесса дыхания. Оптимальное для дыхания парциальное давление кислорода составляет 21%, снижение этого показателя отражается на уровне и структуре процесса дыхания. По прошествии 6 активность данного фермента установилась на значении 16, 13 Е/гр.с.м., а к окончанию опыты составляла 16,1 Е/гр.с.м.