Регуляція С2-метаболізму у Acinetobacter sp. B-7005 – продуцента екзополісахариду етаполану - Автореферат

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім.Робота виконана у відділі біології газоокислюючих мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Пирог Тетяна Павлівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу біології газоокислюючих мікроорганізмів. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів. доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кучмеровська Тамара Муратівна, Інститут біохімії ім О.В.Мікробні полісахариди, як внутрішньоклітинні, так і екзогенні викликають великий інтерес у дослідників - мікробіологів, біохіміків, молекулярних біологів, біотехнологів, тощо. Виявлення таких сайтів метаболічного лімітування, розробка підходів до їхнього усунення і визначення на основі цих знань принципів регуляції енергетичного та конструктивного метаболізму дасть змогу реалізувати біотехнологічні процеси з найвищою ефективністю. Дисертаційна робота включає дослідження, виконані згідно плану науково-дослідних робіт відділу біології газоокислюючих мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології НАН України за темами "Вивчення екології метилотрофних бактерій і регуляції синтезу практично важливих метаболітів" (номер державної реєстрації 0196U003717), "Біологія і біотехнологічні аспекти практичного використання бактерій, які ростуть на С1-С2-субстратах" (номер державної реєстрації 0101U003059). · на основі дослідження регуляції С2-метаболізму вдосконалити процес одержання етаполану на етанолі; Встановлені умови культивування продуцента етаполану, що дають змогу усунути лімітування С2-метаболізму і забезпечують однакову швидкість окиснення етанолу, ацетальдегіду й ацетату, а також підвищення у три рази активності ацетил-КОА-синтетази.Джерелом вуглецю та енергії при одержанні посівного матеріалу і біосинтезі ЕПС були: а) 0,5 % етанолу (за обємом); б) 1 % етанолу (за обємом) за наявності або відсутності ацетату калію (0,1 % або 0,01 %); в) 1 % етанолу (за обємом) у присутності фумарату калію (0,2 %); г) 1,6 % ацетату калію. В-7005 (1НГ) культивування бактерій здійснювали на середовищі 2 з 1 % етанолу до середини експоненційної фази росту (16-18 год), після чого вносили ацетат калію (0-48 ММ). Визначення активності ферментів здійснювали в безклітинних екстрактах: клітини Acinetobacter sp. Активність ацетальдегіддегідрогенази ацилювальної (КФ 1.2.1.10), ацетил-КОА-синтетази (КФ 6.2.1.1) та ацетаткінази аналізували за утворенням ацетил-КОА та ацетилфосфату, що утворюють з гідроксиламіном ацетилгідроксамат. В-7005 (1НГ) і активність ацетил-КОА-синтетази у безклітинному екстракті знижувалася у 1,3-2 рази у присутності Na , що свідчить про лімітування метаболізму катіонами натрію.Встановлено, що незалежно від умов культивування продуцента (вміст мінеральних компонентів, співвідношення С/N та молярність буферу в середовищі культивування), нативні ЕПС характеризувалися практично однаковим вмістом вуглеводів (44,5-46,7 %) і піровиноградної кислоти (3,2-3,7 %) (табл. Проте, полісахариди різнилися за кількістю уронових (7,5-13,8 %), жирних (5,9-8,8 %) кислот, мінеральних компонентів (6,2-28,6 %), а також за вмістом ацильованого компоненту (70-100 %). Після дезацилювання нативних ЕПС вміст уронових кислот збільшувався у 2-3 рази та становив 20-22 % для всіх досліджуваних полісахаридів. Концентрація етанолу 1 %, у середовище 5 додатково вносили 0,1% ацетату калію при одержанні інокуляту і біосинтезі ЕПС. Дослідження молекулярної маси етаполану, синтезованого за різних умов культивування, показало, що середня молекулярна маса полісахаридів, одержаних на середовищах 3 та 5, практично не змінювалася в процесі виділення й очистки і становила 1,5 млн (табл.Визначено особливості енергетичного й конструктивного метаболізму С2-субстратів у Acinetobacter sp. Встановлено, що окиснення етанолу й ацетальдегіду здійснюється НАД і НАДФ -залежними дегідрогеназами, ацетат залучається до метаболізму за участю ацетил-КОА-синтетази. Встановлено, що інгібіторами ацетил-КОА-синтетази є катіони натрію та інтермедіати окиснення етанолу й ацетальдегіду (НАДН і НАДФН), а активаторами - катіони калію і магнію. На основі дослідження регуляції С2-метаболізму розроблено спосіб одержання етаполану, ключовими елементами якого є: відсутність у середовищі культивування катіонів натрію, підвищення у ньому концентрації пантотенату кальцію до 0,0009 %, а також наявність 0,1 % ацетату калію при одержанні інокуляту і біосинтезі полісахариду.