Регуляторна роль Са2 у функціонуванні глутатіонової антиоксидантної системи лімфоцитів крові - Автореферат

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК УДК 612.112.94.015.11.014.23.014.333 дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наукРобота виконана у Львівському державному медичному університеті імені Данила Галицького Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Воробець Зіновій Дмитрович, завідувач кафедри медичної біології та генетики Львівського державного медичного університету ім. Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Костерін Сергій Олексійович, завідувач відділу біохімії мязів, заступник директора з наукової роботи Інституту біохімії ім. Палладіна НАН України доктор біологічних наук, професор Сологуб Леонід Ілліч, завідувач лабораторії обміну речовин Інституту біології тварин УААН. Захист відбудеться “_11_”____березня_____2003 р. о ____12.00_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН: вул. З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м.За нормального функціонування організму постійно підтримується динамічна рівновага між анти-й прооксидною системами. Дослідження на цілих клітинах мають свої особливості та переваги для розуміння механізмів функціонування інтактної клітини, оскільки визначається сумарна активність того чи іншого ферменту в клітині, а не окремих ізоформ, що локалізовані в різних мембранах чи цитозолі. Оскільки внутрішньоклітинний метаболізм лімфоцитів грунтується на фізіологічно закріпленій здатності цих клітини швидко реагувати на будь-які зміни гомеостазу в організмі і модуляція активності ферментів у лімфоцитах настає значно раніше, ніж змінюються морфологічні та біохімічні показники (Oltra Дослідити інтенсивність накопичення малонового діальдегіду (МДА), Ca2 ,Mg2 -АТФАЗНУ, Na ,K -АТФАЗНУ активність і вплив Са2 на ферменти глутатіонової антиоксидантної системи лімфоцитів. Дослідити вміст малонового діальдегіду, відновленого глутатіону, а також Ca2 ,Mg2 -АТФАЗНУ активність та активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи лімфоцитів за умов окиснювального стресу.У дослідах використовували моноядерні лімфоцити периферичної крові людини, які виділяли методом центрифугування в градієнті концентрації фікол-урографину (r=1,077) за методом Boum А.А., (1968) з гепаринізованої свіжоотриманої крові клінічно здорових осіб віком 21-28 років, розведеної у співвідношенні 1:3 розчином Хенкса без Са2 і Mg 2 . Для вивчення ферментативної активності лімфоцитарну суміш центрифугували 30 хв при 800 g та відбирали надосадову рідину, а лімфоцити ресуспендували у співвідношенні 1:1 у 0,9% NACL, що містив ЕДТА у кінцевій концентрації 0,1%. Для виявлення глутатіонредуктазної, глутатіонтрансферазної, глутатіонредуктазної та Na ,K -АТФАЗНОЇ латентної активності до суспензії лімфоцитів додавали 0,2 % сапонін, а для визначення глутатіонпероксидазної та Ca2 ,Mg 2 -АТФАЗНОЇ активності - 0,1% сапонін. Вміст білка в суспензії лімфоцитів визначали за методом, описаним Lowry О. et al., (1951). Глутатіонпероксидазну активність визначали за зменшенням вмісту GSH (Моин В.М., 1986), глутатіонредуктазну активність - за зменшенням вмісту NADPH (Mannervik B., 1991; Власова С.Н. и др., 1990), глутатіонтрансферазну активність - за зменшенням вмісту GSH (Власова С.Н. и др., 1990; Булавин Д.В., 1996), інтенсивність ПОЛ оцінювали за вмістом одного з кінцевих метаболітів - малонового діальдегіду (Тимирбулатов С.А., Селезнев Е.И., 1998).Оскільки функціонування будь-яких ферментів залежить від багатьох чинників, метою другого етапу роботи був добір оптимальних значень таких показників, як РН, концентрація сапоніну, білка, АТФ, співввідношення катіонів Na і K , час інкубації для визначення Са2 ,Mg2 -АТФАЗНОЇ та Na ,K -АТФАЗНОЇ активності лімфоцитів крові. У результаті вивчення процесу гідролізу АТФ Са2 ,Mg2 -АТФАЗОЮ лімфоцитів залежно від часу виявлено, що активність цього ферменту становить 2,0±0,1 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв, за 20 хв інкубації досягає максимального значення (4,5±0,3 мкмоль Фн/мг білка), а при збільшенні часу інкубації до 30 хв знижується до 1,3±0,1 мкмоль Фн/мг білка. Na ,K -АТФАЗНА активність при концентрації білка 0,15 мг/мл становила 6,3±0,5 МКМОЛЬФН/мг білка за 1 хв, а при збільшенні концентрації білка до 0,45 мг/мл знижувалась до 0,9±0,3 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв та характеризувалась відповідною залежністю. Са2 ,Mg2 -АТФАЗНА активність виявилася найвищою за наявності у середовищі інкубації АТФ у концентрації 5 ММ і становила 3,9±0,3 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв. Для визначення залежності Ca2 ,Mg 2 -АТФАЗНОЇ, глутатіонпероксидазної, глутатіонредуктазної та глутатіонтрансферазної активності від концентрації Са2 , його вносили у вигляді CACL2 в інкубаційне середовище у концентраціях 0,01 ММ...2 ММ.