Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК - Дипломная работа

С возникновением принципиально новых направлений в науке, в клинической диагностике успешно начали применяться методы ДНК-технологий среди которых, безусловно, первое место занимают полимеразная цепная реакция (ПЦР). Этот метод появился сравнительно недавно, но уже интенсивно применяется в практике. Цель работы - это попытка создать модель диагностической системы за счет объединения преимуществ двух методов - количественного вида ПЦР - Real Time и биочипового анализа, в связи с чем были поставлены следующие задачи : изготовление микропланшетов с лунками, общий объем которых не должен превышать 2мкл (в настоящее время используются микроплашки с лунками, рассчитанные на 200 мкл), перевод реакции в формат микрочипа и отработка условий ПЦР в микрообъеме (обычно ПЦР ставят в объеме 20-30 мкл,в формате биочипа общий объем реакционной смеси не должен превышать 1-2 мкл).Первые сообщения по практическому применению метода появились в 1985 г.[18] С тех пор количество публикаций, где ПЦР используется в качестве одного из методов исследования, занимает одно из первых мест наряду с работами, в которых применяются автоматическое определение нуклеотидной последовательности (сиквенирование ДНК) и гибридизационные технологии.[7]Существует большое количество способов получить данные о концентрации нуклеиновых кислот в пробе методом ПЦР, но все они требуют дополнительных трудоемких этапов работы, связанных с предварительной раститровкой выделенной из анализируемой пробы ДНК, или полученных в ходе ПЦР ампликонов, что приводит к увеличению времени, необходимого для постановки анализа и сложности интерпретации полученных результатов [12 ,15]. Также, наличие дополнительных этапов работы увеличивает вероятность ошибки и получения недостоверного результата. На сегодня существует метод, лишенный вышеперечисленных недостатков - это метод ПЦР в реальном времени (REALTIME PCR) [14 ].В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5"-положении и гаситель флуоресценции в 3"-положении, а также фосфатная группа в 3"-положении. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3"-положении блокирует полимеразу (Рис. 1) В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Данный способ детекции накопления продуктов амплификации отличается повышенной специфичностью, так как увеличение флуоресценции происходит при комплементарном связывании с ампликонами сразу 2-х ДНК зондов [11 ] (Рис 3). Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3` конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5` конце второго зонда, причем расстояние между флуорофорами составляет 1-3 нуклеотида.Флуоресцентные красители обеспечивают флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR). Экспоненциальная стадия PCR описывается уравнением: Pn = P0 * E n (1) (www.molbiol.ru ), где Pn - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P0 - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. Для SYBR Green, как правило, хорошо работает расчет базового уровня по среднему значению в диапазоне циклов с 3 по 7 (первые 2 цикла не влючают в диапазон, поскольку на них может наблюдаться более сильная флуоресценция изза недостаточно стабилизировавшейся реакции). Как уже было сказано выше, в таком случае начальный цикл диапазона нужно выбирать такой, в котором флуоресценция от "сломанных проб" уже достигла минимума.В последнее время активно развиваются ДНК-технологии, которые позволяют не только определять признак, но и одновременно проводить дифференциальный сиквенс, т.е. определение точечных мутаций или полиморфизма в известных участках генома. Данные технологии имеют значительные преимущества перед традиционными молекулярно-биологическими методами, т.к. они позволяют миниатюризировать исследуемый образец и анализатор, что значительно снижает стоимость анализа и время его проведения, а также одновременно определять различные параметры исследуемого образца, причем без потери чувствительности амплификационных методов [6]. Наличие на чипе олигонуклеотида любой последовательности делает возможным анализ любой исследуемой последовательности [4]. Собственно биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность. Количество различных зондов на подложке может достигать сотен тысяч, причем чипы каждого типа строго идентичны и при

Содержание

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Real Time ПЦР

1.1.1 Виды REALTIME ПЦР

1.1.2 Кинетические параметры

1.2 Биологические микрочипы

1.2.1. ДНК-микрочипы

1.2.2. Гибридизация-основа технологии

1.2.3. Применение ДНК-чипов

Глава 2. Материал и методы

2.1 Изготовление микропланшетов

2.2 Определение спектра поглощения и эмиссии SYBR green

2.3 Протоколы ПЦР

2.3.1 Постановка реакции с использованием фирменного набора(СИСТЕМАSYB green)

2.3.2 Постановка реакции без использования фирменного набора(СИСТЕМАSYBGREEN )

2.3.3 Протокол полимеразной цепной реакции с использованием TAQMAN

2.4 Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации

2.5 Система детекции результатов анализа

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Определение зависимости сигнала флуоресценции от концентрации ДНК

3.2 Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках

3.3 Проведение ПЦР в пластиковых микропланшетах

3.4 Постановка ПЦР в микрообъемах с отрицательными контролями

3.5 Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации

Выводы

Заключение

Список литературы

С возникновением принципиально новых направлений в науке, в клинической диагностике успешно начали применяться методы ДНК-технологий среди которых, безусловно, первое место занимают полимеразная цепная реакция (ПЦР). Не менее мощным и уникальным по своим характеристикам методом является анализ с использованием биологических микрочипов. Этот метод появился сравнительно недавно, но уже интенсивно применяется в практике.

В основе всех ДНК-технологий, лежат процессы амплификации и регистрации молекул ДНК.

Оптимизация условий данных процессов позволит увеличить производительность, снизить стоимость анализа и повысить его качество. Одним из возможных путей решения этого вопроса является объединение в единую технологическую схему современных подходов в детекции ДНК.

В настоящее время возможные применения подобных схем находятся на стадии разработки в ряде зарубежных лабораторий. Наиболее вероятным направлением ближайшего их применения является молекулярная диагностика наследственных заболеваний и другие практические приложения, основанные на выявлении однонуклеотидных полиморфизмов последовательностей ДНК человека.

Цель работы - это попытка создать модель диагностической системы за счет объединения преимуществ двух методов - количественного вида ПЦР - Real Time и биочипового анализа, в связи с чем были поставлены следующие задачи : изготовление микропланшетов с лунками, общий объем которых не должен превышать 2мкл (в настоящее время используются микроплашки с лунками, рассчитанные на 200 мкл), перевод реакции в формат микрочипа и отработка условий ПЦР в микрообъеме (обычно ПЦР ставят в объеме 20-30 мкл,в формате биочипа общий объем реакционной смеси не должен превышать 1-2 мкл).

Работа выполнялась на базе лаборатории клеточной инженерии Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, г. Пущино.