Характеристика молочных консервов. Состояния, связанные с лактазной недостаточностью. Применение иммобилизованных ферментов. Технологическая схема производства вареного сгущенного молока "Семь гномов". Описание аппаратно-процессной схемы производства.
При низкой оригинальности работы "Разработка технологии иммобилизации B-галктозидазы и оценка её биологического действия на молоко и некоторые молочные продукты", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
По своему содержанию, целям и задачам биотехнология становится важнейшей составной частью экономики мира, в том числе и агропромышленного производства. Большое внимание уделено разработке и освоению новейших биотехнологий в растениеводстве, животноводстве, ветеринарной медицине, хранении, транспортировке и переработке сельскохозяйственной продукции, получению и использованию биологически активных веществ, кормовых добавок и др. В биотехнологии видят одно из средств для преодоления продовольственных, энергетических, сырьевых и экологических проблем. Интерес представляет использование иммобилизованной лактазы в производстве вареного сгущенного молока “Семь гномов”, выпускаемого на ООО “Маслосырбаза “Энгельсская”. Инженерная часть дипломного проекта, а также разделы “Безопасность жизнедеятельности” и “Экология” выполнялись на базе предприятия ООО “Маслосырбаза “Энгельсская”.Его используют в кондитерской промышленности для производства ириса, молочных (типа «Коровки»), сбивных, помадных и ликерных конфет, ассорти, начинок для конфет; в производстве мороженого; в хлебопекарной промышленности - для производства тортов, пирожных, рулетов, кремов. Использование сухого молочного сырья и растительных жиров при производстве сгущенного молока с сахаром также решает такие проблемы, как дефицит молочного сырья и снижение себестоимости продукта. Сухое молоко, жиры и специальные смеси, используемые в качестве ингредиентов при производстве рекомбинированных молочных консервов, должны быть хорошего качества и обладать необходимыми функциональными характеристиками, обеспечивающими готовый продукт определенными свойствами. Фермент ?-галактозидаза осуществляет гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы, которые имеют более высокую биологическую ценность, чем исходный дисахарид лактоза. Фермент осуществляет гидролиз ?-В-галактозидных связей, отщепляя галактозидные остатки с невосстанавливающегося конца галактозидов: олигосахаридов, полисахаридов, гликолипидов, гликопептидов, гликопротеинов, мукополисахаридов.Молочные продукты сгущенные, вареные, вырабатывают из молочного сырья: сливочного масла, сухого молока, ферментов, наполнителей путем составления смеси согласно рецептурам, ее тепловой обработке в аппаратах специальной конструкции. Продукт предназначен для непосредственного употребления в пищу [37]. По микробиологическим показателям продукт должен соответствовать требованиям, указанным в таблице 1.1: Таблица 2.1 - Микробиологические показатели продукта По физико-химическим показателям продукт должен соответствовать требованиям, указанным в таблице 1.2: Таблица 2.2 - Физико-химические показатели продукта Допускаются к переработке молоко и другие молочные продукты с отклонением от установленных норм по внешнему виду, консистенции и вкусу, а также по массовой доле влаги, жира, учитываемые при расчете рецептур: - кальций углекислый (Е170) по ГОСТ 4530;Добавляли фермент ?-галактозидазу в 3-х концентрациях: 0,01; 0,02 и 0,03% и отмечали изменение концентрации лактозы через 3, 6 и 24 часа. Данные результатов исследования занесли в таблицу: Таблица 2.7 - Изменение содержания лактозы в коровьем молоке под влиянием ?-галактозидазы При добавлении 0,02% концентрации ?-галактозидазы содержание лактозы в сухом молоке снизилось еще более значительно (за сутки с 4,03 до 2,59%) и составляет 64,26% от начального значения. Для исследования брали невареное сгущенное молоко по ГОСТ 2903-78, добавляли фермент ?-галактазидазу в трех концентрациях и определяли изменение содержания лактозы через 3, 6 и 24 часа. Добавить в исследуемое вареное сгущенное молоко “Семь гномов ”раствора фермента ?-галактозидазы в 3-х концентрациях и определить изменение содержания лактозы через 3, 6 и 24 часа.3.1 Описание АПС до реконструкции сгущенный молоко производство фермент лактоза В аппаратурно-процессовую схему производства вареного сгущенного молока “Семь гномов” входит следующее оборудование: танк Я1-ОСВ-1. загрузочная воронка диспергатор Я9-ОРП фасовочный автомат АЛУР-1500. Через воронку 2 в смесь вносят сахар-песок, проводят сгущение 2-3 часа, затем сгущенное молоко охлаждают. Полученное вареное сгущенное молоко охлаждают и из танка 1 молоко поступает на фасовку в фасовочный автомат АЛУР-1500 5. Установка предназначена для автоматического фасования (объемного дозирования и герметичного запечатывания) подогретых плавленых сыров и других жидких и пастообразных продуктов без подогрева (соков, растительных масел, молочных продуктов) в полипропиленовые стаканчики диаметром до 95 мм (наружный диаметр отбортовки) максимальной высотой 122 мм и объемом до 500 мм (ТУ 2291-047-004, 19789-96, ТУ 2297-409-00203096-96) с автоматической герметизацией стаканчиков крышками из алюминиевой фольги термолаковым покрытием по ТУ 1119-004-00472673-96, ТУ 28008-00419787-95, разрешенных Госкомсанэпиднадзором России для контакта с пищевыми продуктами, и установки пластмассовых крышек (поверх алюминиевых) для многоразоваго использования продукта.Роторно-пульсационный аппарат предназначен дл
Введение
По своему содержанию, целям и задачам биотехнология становится важнейшей составной частью экономики мира, в том числе и агропромышленного производства. Большое внимание уделено разработке и освоению новейших биотехнологий в растениеводстве, животноводстве, ветеринарной медицине, хранении, транспортировке и переработке сельскохозяйственной продукции, получению и использованию биологически активных веществ, кормовых добавок и др. В биотехнологии видят одно из средств для преодоления продовольственных, энергетических, сырьевых и экологических проблем.
Для пищевой, кондитерской и медицинской промышленности большое экономическое значение имеет биотехнология производства и использования ферментных препаратов.
Биологическим объектом для изучения в данном дипломном проекте является фермент микробиологического происхождения ?-галактозидаза; его иммобилизация и использование в молоке и молочных продуктах. Интерес представляет использование иммобилизованной лактазы в производстве вареного сгущенного молока “Семь гномов”, выпускаемого на ООО “Маслосырбаза “Энгельсская”.
Инженерная часть дипломного проекта, а также разделы “Безопасность жизнедеятельности” и “Экология” выполнялись на базе предприятия ООО “Маслосырбаза “Энгельсская”. Научно-исследовательская работа проводилась в научной лаборатории кафедры биотехнологии, органической и биологической химии СГАУ им. Н.И. Вавилова.
На основании изложенного можно сформулировать цель и задачи дипломного проекта.
Цель проекта: разработка технологии иммобилизации ??галактозидазы.
Задачи: - оценить действие нативного фермента на снижение концентрации лактозы в молочных продуктах;
- оценить активность и продолжительность действия иммобилизованного фермента;
- ввести иммобилизованную ?-галактозидазу в молоко цельное, сухое и сгущенное и оценить действие фермента на степень снижения в них содержания лактозы;
- на базе разработки технологии иммобилизации фермента усовершенствовать технологическую линию производства вареного сгущенного молока “Семь гномов”;
- просчитать экономическую эффективность проектируемого продукта и целесообразность его производства.
Молочные продукты, обладающие лечебно-профилактическими свойствами и качественным сырьевым составом, пользуются большим спросом у населения. Применение иммобилизованных ферментов в производстве таких продуктов является актуальным в современной пищевой биотехнологии. Поэтому поставленные цель и задачи дипломного проекта можно считать важными и необходимыми для выполнения.
Вывод
Первая серия экспериментов.
1. Цельное молоко.
Для проведения опыта брали свежее коровье молоко 2,5% жирности. Добавляли фермент ?-галактозидазу в 3-х концентрациях: 0,01; 0,02 и 0,03% и отмечали изменение концентрации лактозы через 3, 6 и 24 часа. Данные результатов исследования занесли в таблицу: Таблица 2.7 - Изменение содержания лактозы в коровьем молоке под влиянием ?-галактозидазы
Группа Время измерения, ч
1 3 6 24
Контроль % % Р Р 4,87±0,18 100 100 4,72±0,13 100 96,91 >0,05 4,56±0,11 100 93,63 >0,05 4,49±0,09 100 92,19 <0,001
1 % % Р Р 4,31±0,05 88,50 100 0,05 3,57±0,13 78,29 82,83 <0,01 <0,001 3,39±0,17 77,22 78,65 <0,001 <0,001
2 % % Р Р 4,06±0,13 83,73 100 0,05 3,39±0,18 74,34 83,49 0,05 3,18±0,13 72,43 78,32 <0,001 <0,001
3 % % Р Р 3,76±0,17 77,20 100 0,05 3,13±0,13 68,64 83,24 <0,001 <0,05 2,97±0,13 67,65 78,98 <0,001 <0,01
Примечания: Контроль - концентрация лактозы в коровьем молоке.
1 - концентрация лактозы в коровьем молоке с 0,01%-ной ?-галактозидазой.
2 - концентрация лактозы в коровьем молоке с 0,02%-ной ?-галактозидазой.
3 - концентрация лактозы в коровьем молоке с 0,03%-ной ?-галактозидазой.
Р - достоверность относительно контроля
Р - достоверность относительно первого часа наблюдения.
% - процент падения лактозы относительно контрольной пробы.
% - процент падения лактозы относительно первого часа наблюдения.
Выводы. Концентрация лактозы в коровьем молоке находится в пределах норм. В контрольной группе - коровьем молоке свежем без добавления фермента - изменение содержания лактозы с течением времени незначительное (4,87±0,18-4,49±0,09). При добавлении минимальной концентрации фермента (0,01%) через сутки концентрация лактозы снизилась до 3,39±0,17 и составила 78,65% от первоначальной. По сравнению с контролем процент падения равен 88,50% в начале опыта и 77,22% через сутки.
При добавлении 0,02% ?-галактозидазы по сравнению с контролем процент падения увеличился (72,43% после окончания опыта), т.е. эта концентрация фермента более эффективна, чем 0,01%.
При добавлении 0,03% ?-галактозидазы содержание лактозы резко падает по сравнению с контрольной группой (77,20% в начале опыта и 67,65% через 24 часа).
Можно сказать, что наиболее эффективная концентрация лактозы в коровьем молоке - 0,03%, с ее введением удалось добиться снижения концентрации лактозы на 32,35%.
2. Сухое молоко
Количество сухих веществ в коровьем молоке составляет 10-14%. Необходимо определить, в каком соотношении разводить сухое молоко, чтобы добиться консистенции коровьего. а) берем 3 тигля, нумеруем и взвешиваем.
Масса тигля № 1 = 17,8г.
Масса тигля №2 = 18,4г.
Масса тигля №3 = 17,1г. б) прибавляем в тигли по 10г сухого молока: Масса тигля №1 = 27,8г.
Масса тигля №2 = 28,4г.
Масса тигля №3 = 27,1г. в) ставим тигли в термостат (100-110?C) и высушиваем до постоянной массы. После охлаждения в эксикаторе проводим повторное взвешивание: Масса тигля №1 после сушки = 27,0г.
Масса тигля №2 после сушки = 27,5г.
Масса тигля №3 после сушки = 26,4г. г) определим постоянную массу сухого молока (разность массы тигля после сушки и массы пустого тигля): Тигель №1 = 9,2г.
Тигель №2 = 9,1г.
Тигель №3 = 9,3г.
Масса сухого молока = 9,2г.
Количество сухих веществ в сухом молоке чуть меньше, чем в свежем коровьем. Для разведения брали 15г сухого молока и 85мл дистиллированной воды.
Повторили все операции пункта 1 для сухого молока. Данные результатов исследования занесли в таблицу.
Таблица 2.8 - Изменение содержания лактозы в сухом молоке под влиянием ?-галактозидазы
Группа Время измерения, ч
1 3 6 24
Контроль % % Р Р 4,69±0,12 100 100 4,48±0,04 100 95,52 >0,05 4,35±0,14 100 92,75 >0,05 4,22±0,21 100 89,97 >0,05
3 % % Р Р 3,72±0,12 79,31 100 0,05 2,93±0,17 67,35 78,76 <0,001 <0,01 2,29±0,08 54,26 61,56 <0,001 <0,001
Примечания: Контроль - концентрация лактозы в коровьем молоке.
1 - концентрация лактозы в сухом молоке с 0,01%-ной ?-галактозидазой.
2 - концентрация лактозы в сухом молоке с 0,02%-ной ?-галактозидазой.
3 - концентрация лактозы в сухом молоке с 0,03%-ной ?-галактозидазой.
Р - достоверность относительно контроля
Р - достоверность относительно первого часа наблюдения.
% - процент падения лактозы относительно контрольной пробы.
% - процент падения лактозы относительно первого часа наблюдения.
Выводы: В контрольной группе - сухом молоке - изменение содержания лактозы не столь значительно (за 24 часа упала с 4,69% до 4,22%).
При внесении в сухое молоко 0,01% концентрации ?-галактозидазы содержание лактозы падает более значительно (с 4,65 до 3,32%) и по окончании опыта составляет 71,39% от первоначального.
При добавлении 0,02% концентрации ?-галактозидазы содержание лактозы в сухом молоке снизилось еще более значительно ( за сутки с 4,03 до 2,59%) и составляет 64,26% от начального значения. По отношению к контролю процент падения за сутки равен 61,37.
Максимального результата удалось добиться при внесении ?-галактозидазы в концентрации 0,03%. За сутки концентрация лактозы снизилась с 3,72 до 2,29%. По отношению к контрольной группе после окончания опыта содержание лактозы составило 54,56%, т.е. уменьшилось почти вдвое. Итак, 0,03%-я концентрация ?-галактозидазы наиболее эффективна для снижения содержания лактозы в сухом молоке.
3. Сравнение содержания лактозы в сгущенном молоке вареном с ферментом и без фермента.
Для исследования брали вареное сгущенное молоко по ГОСТ 2903-78, определяли изменение концентрации лактозы в течение суток. Затем прибавляли ?-гактозидазу в концентрациях 0,01%; 0,02% и 0,03% и проводили измерения, аналогичные предыдущим опытам. Результаты измерений представлены в таблице 2.9.
Таблица 2.9 - Изменение содержания лактозы в вареном сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78
Группа Время измерения, ч
1 3 6 24
Контроль % % Р Р 4,60±0,17 100 100 4,58±0,11 100 99,56 0,05 4,55±0,19 100 98,91 >0,05
3 % % Р Р 3,71±0,13 80,65 100 0,05 2,85±0,07 62,63 78,62 <0,001 <0,001 2?53±0,11 55,60 68,19 <0,001 <0,001
Примечания: Контроль - концентрация лактозы в сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78 .
1 - концентрация лактозы в сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78 с 0,01%-ной ?-галактозидазой.
2 - концентрация лактозы в сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78с 0,02%-ной ?-галактозидазой.
3 - концентрация лактозы в сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78с 0,03%-ной ?-галактозидазой.
Р - достоверность относительно контроля
Р - достоверность относительно первого часа наблюдения.
% - процент падения лактозы относительно контрольной пробы.
% - процент падения лактозы относительно первого часа наблюдения.
Выводы: Содержание молочного сахара в сгущенном молоке вареном по ГОСТ 2903-78 находится в пределах норм и с течением времени изменяется незначительно (с 4,60% до 4,55%). При добавлении ?-галактозидазы в концентрациях 0,01; 0,02 и 0,03% отмечается снижение содержания лактозы как с увеличением концентрации, так и с течением времени. При добавлении 0,01% фермента концентрация составила 89,13% от контрольной, а при 0,03% - уже 80,65%. Через 24 часа эта разница стала еще более отчетливо выраженной: при добавлении 0,01% фермента концентрация лактозы составила 61,76% от контрольной, а при 0,03% - 55,60%. Наиболее эффективной является концентрация ?-галактозидазы 0,03%, при ней максимальное количество лактозы переходит в смесь моносахаров.
4. Невареное сгущенное молоко
Для исследования брали невареное сгущенное молоко по ГОСТ 2903-78, добавляли фермент ?-галактазидазу в трех концентрациях и определяли изменение содержания лактозы через 3, 6 и 24 часа.
Результаты исследования представлены в таблице.
Таблица 2.10 - Изменение содержания лактозы в невареном сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78
Группа Время измерения, ч
1 3 6 24
Контроль % % Р Р 4,91±0,17 100 100 4,73±0,09 100 96,33 >0,05 4,48±0,12 100 91,24 >0,05 4,23±0,09 100 86,15 <0,01
3 % % Р Р 3,65±0,18 74,33 100 0,05 3,05±0,09 68,08 83,56 <0,001 <0,001 2,48±0,12 68,08 67,94 <0,001 <0,001
Примечания: Контроль - концентрация лактозы в сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78 .
1 - концентрация лактозы в невареном сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78 с 0,01%-ной ?-галактозидазой.
2 - концентрация лактозы в невареном сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78с 0,02%-ной ?-галактозидазой.
3 - концентрация лактозы в невареном сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78с 0,03%-ной ?-галактозидазой.
Р - достоверность относительно контроля
Р - достоверность относительно первого часа наблюдения.
% - процент падения лактозы относительно контрольной пробы.
% - процент падения лактозы относительно первого часа наблюдения.
Выводы: В невареном сгущенном молоке изменение содержания лактозы после 24 часов с начала опыта выражено более значительно (с 4,91±0,17 упала до 4,23±0,09) и составила 86,15% от первоначального. Это может быть объяснено тем, что произошло образование кристаллов лактозы крупных размеров.
При внесении 0,01%-ного раствора ??галактзидазы содержание лактозы снизилось с 4,87±0,11 до 3,68±0,08 за сутки с составило 76,56% от начальной концентрации.
0,02%-ный раствор ??галактозидазы является более эффективным, чем 0,01%. При внесении 0,02%-ного раствора фермента содержание лактозы через сутки с начала опыта составило 70,06% от первоначального (с 4,8±0,12 снизилась до 3,37±0,08).
При добавлении 0,03% раствора ??галактозидазы процент падения содержания лактозы в невареном сгущенном молоке наибольший и через сутки составляет 67,94% с начала опыта. Таким образом, удалось добиться снижения концентрации лактозы в невареном сгущенном молоке на 31,92% при внесении максимальной концентрации фермента.
5. Добавить в исследуемое вареное сгущенное молоко “Семь гномов ” раствора фермента ??галактозидазы в 3-х концентрациях и определить изменение содержания лактозы через 3, 6 и 24 часа. Данные результатов исследования заносим в таблицу.
Таблица 2.11 - Изменение содержания лактозы в сгущенном молоке “Семь гномов” под влиянием ??галактозидазы
Группа Время измерения, ч
1 3 6 24
Контроль % % Р Р 4,00±0,13 100 100 3,93±0,11 100 98,25 >0,05 3,86±0,08 100 96,51 >0,05 3,78±0,06 100 94,50 >0,05
1 % % Р Р 2,31±0,09 57,75 100 0,05 1,88±0,09 48,71 81,39 <0,05 <0,01 1,71±0,10 45,24 74,03 <0,001 <0,01
2 % % Р Р 2,10±0,11 52,51 100 0,05 1,67±0,10 43,25 79,52 <0,05 <0,05 1,28±0,06 33,86 60,96 <0,001 <0,001
3 % % Р Р 1,90±0,18 45,79 100 0,05 1,325±0,07 34,20 69,47 <0,01 <0,05 1,14±0,24 30,16 60,00 <0,001 <0,05
Примечания: Контроль - концентрация лактозы в сгущенном молоке “Семь гномов”.
1 - концентрация лактозы в сгущенном молоке “Семь гномов” с 0,01%-ной ?-галактозидазой.
2 - концентрация лактозы в сгущенном молоке “Семь гномов” с 0,02%-ной ?-галактозидазой.
3 - концентрация лактозы в сгущенном молоке “Семь гномов” с 0,03%-ной ?-галактозидазой.
Р - достоверность относительно контроля
Р - достоверность относительно первого часа наблюдения.
% - процент падения лактозы относительно контрольной пробы.
% - процент падения лактозы относительно первого часа наблюдения.
Выводы: Содержание лактозы в исследуемом продукте - сгущенном вареном молоке “Семь гномов” находится в пределах норм и с течением времени практически не изменяется. За сутки показатели изменились с 4,00±0,13 до 3,78±0,06, что составляет 94,5% от первоначального. При внесении же фермента содержание лактозы резко уменьшается как с течением времени, так и с увеличением концентрации. При добавлении 0,01%-го раствора ??галактозидазы через сутки содержание лактозы упало с 2,31±0,09 до 1,71±0,10, и составила 45,24% от концентрации лактозы в сгущенном молоке без фермента. Наиболее заметных результатов удалось достигнуть, прибавляя 0,03%-й раствор ??галактозидазы. Через 24 часа после внесения фермента содержание лактозы снизилось с 1,90±0,18 до 1,14±0,24. Таким образом, концентрация лактозы в этой группе составила 30,16% от контрольной, а с течением времени снизилась на 40%.
Очевидно, что 0,01% и 0,02%-ные растворы ??галактозидазы менее эффективны, чем 0,03%-й раствор. Однако все три концентрации фермента дают значительное снижение содержания лактозы по сравнению со сгущенным молоком без внесенного фермента.
Вторая серия экспериментов.
Подготовка носителей для иммобилизации.
Первоначально для иммобилизации ?-галактозидазы были выбраны следующие носители: силикагель, акриламид, крахмал, асбестовое волокно, лавсановое волокно, древесные опилки.
Акриламид широко используется для иммобилизации. Однако изза отсутсвия ’N,N-метиленбисакриламида (или бис-акриламида) , который в полиакриламидном геле отвечает за образование поперечных сшивок, использование его в данном случае невозможно.
Силикагель по своей химической природе является оксидом кремния: Si(OH) . Он химически неактивен, имеет хорошие адсорбционные свойства. Преставляет собой частицы округлой формы с диаметром 0,03-0,4см.
Крахмал отличается значительной гидрофильностью, образует достаточно плотные гели, и сам по себе не вступает в реакции с ферментом. Однако 3% и 5% крахмальные гели растворились при попытке иммобилизации в растворе фермента, а 10% гель не показал желаемых результатов.
Древесные опилки - достаточно редкий носитель для иммобилизации. Однако опилки обладают большой удельной поверхностью, гидрофильностью, они дешевы, поэтому представляют интерес для исследования.
Асбест (3MGO·2SIO2·2H2O) - гидросиликат магния, по химическому составу близкий хорошо известному всем минералу тальку (3MGO·4SIO2·H20), т.е. с химической точки зрения он абсолютно безвреден для организма. Представляет собой тончайшие полые трубочки-фибриллы диаметром 2,6·10-5мм, кристаллы напоминают мягкие целлюлозные волокна хлопковой ваты. Будучи материалом неорганическим, волокна асбеста не горят и выдерживают высокие температуры. Лишь при нагреве до 700 °С они теряют химически связанную воду и делаются хрупкими. Удельная поверхность асбеста 20м /г.
Асбест - это собирательное товарное название группы минералов, которые встречаются в природе в виде пучков волокон. Выделяются две группы минералов, отличающихся друг от друга по химическому составу, технологическим свойствам и степени влияния на организм человека - серпентиниты и амфиболы, в коммерческом использовании именующихся общим названием "асбест". Научные исследования, проведенные экологическими организациями, привели к нескольким основным выводам: - влияние различных видов асбеста на организм человека различно. Наибольшую опасность представляли амфиболы (амозит, крокидолит, антофиллит, тремолит). В настоящее время добыча и использование этого вида асбеста запрещена во всем мире;
- хризотил представляет наименьшую опасность, даже по сравнению с искусственными заменителями и натуральными волокнам (целлюлоза), так как быстрее других волокон выводится из легких; - наибольшую опасность представляла технология напыления асбеста с налипанием (рыхлый асбест) на металлические конструкции зданий, судов и т.п. для целей пожаро- и теплоизоляции. Эта технология также запрещена к использованию.
Таким образом, в настоящее время единственным видом асбеста, используемым на мировом рынке, является хризотил. Производители применяют политику контролируемого ответственного использования хризотила, направленную на снижение риска негативного воздействия на здоровье людей, прежде всего рабочих, занятых на производстве.
Лавсан - химическое синтетическое полиэфирное волокно. По своему составу - сложный эфир терефталевой кислоты и этиленгликоля. Лавсан химически инертен, устойчив к действию щелочей, кислот, микроорганизмов; обладает высокой прочностью, упругостью, термостойкостью. Недостаток - менее гидрофилен, чем другие носители.
Крахмал и лавсан, как химические чистые носители, использовались в первоначальном состоянии без подготовки. Асбест, опилки силикагель подготавливают следующим образом. Силикагель был просеян, промыт водой, прокипячен 10 мин в воде. Асбест и опилки не кипятили. Затем носители промывают в 1Н растворе NAOH, заново промывают водой, потом промывают в 1Н HCL , снова водой и отмачивают 1 час в дистиллированной воде. Данную процедуру повторяют два раза, после этого носители хранят в закрытом сосуде в дистиллированной воде, покрывающей поверхность носителя. Такая процедура необходима для достижения максимального очищения адсорбционной поверхности носителя от органических и неорганических веществ.
Оценка активности иммобилизованного фермента. Выявление неэффективных носителей.
Опыт иммобилизации ?-галактозидазы на носителях с выдержкой носителя в 0,01 и 0,03% растворах фермента 1 сутки.
В колбах приготавливается по 100мл 0,01 и 0,03% растворы ?-галактозидазы, затем вносилось по 10г асбеста, силикагеля, крахмала 10%-го, опилок и лавсана. После этого колбы оставляли при периодическом встряхивании на сутки. После данной процедуры носители с иммобилизованным ферментом промывались дистиллированной водой. В колбах приготавливался 100мл 5% раствора лактозы и вносились носители с иммобилизованной ?-галактозидазой. Колбы помещали в термостат с температурой гидролиза 38?C. Степень снижения концентрации лактозы определяли через 1,2 и 3 суток рефрактометрическим методом. Дальнейшее выдерживание невозможно изза испарения раствора.
На 10% геле крахмала не удалось иммобилизовать фермент.
Эффективность действия фермента в 2-х концентрациях, иммобилизованного на других носителях, представлена в таблицах 2.12 и 2.13.
Таблица 2.12 - Эффективность действия 0,01% ?-галактозидазы на снижение концентрации лактозы (исходный раствор лактозы - 5%-й)
% - процент падения лактозы относительно контроля;
Р - достоверность относительно контроля.
Выводы. На эффективность действия были исследованы: нативная ?-галактозидаза в концентрациях 0,01% и 0,03%, а также фермент, иммобилизованный на лавсане, силикагеле, асбесте и древесных опилках. При гидролизе нативным ферментом концентрация лактозы за 1 сутки резко снизилась (при 0,01% ферменте - на 29%, при 0,03% - на 40,5%), а затем изменялась незначительно, т.е. за сутки он практически инактивировался. При гидролизе иммобилизованная на лавсане, асбесте и опилках ?-галактозидаза эффективно действовала даже на 3 сутки: при 0,01% ферменте концентрация по сравнению с контролем составила 37,2; 40,05 и 48%, а при 0,03% ферменте - 51,1; 46 и 65% соответственно на лавсане, асбесте и опилках. Фермент, иммобилизованный на силикагеле, не показал желаемого снижения концентрации лактозы.
Оценка продолжительности действия иммобилизованного фермента на снижение концентрации лактозы.
Следующим этапом исследования необходимо было выяснить продолжительность действия и срок хранения фермента.
Повторялась процедура иммобилизации фермента на лавсане, асбесте и опилках. 10г каждого носителя с ферментом вносили в 100мл 5% раствора лактозы. После выдерживания в термостате 1 сутки рефрактометрическим методом определяли снижение лактозы в растворе. После этого носитель извлекали из раствора, промывали дистиллированной водой и помещали на 1 сутки в холодильник при температуре 4?C. Затем вынимали стаканчики с иммобилизованным на носителях ферментом, нагревали до комнатной температуры и помещали в свежеприготовленный 5% раствор лактозы. Через сутки снова определяли концентрацию лактозы. Данную процедуру повторяли через 3,5,7,10 и 15 суток до достижения практически полной инактивации фермента. Статистически обработанные данные этой серии экспериментов представлены в таблицах 2.14 и 2.15.
Таблица 2.14 - Продолжительность действия 0,01% иммобилизованной ?-галактозидазы на снижение концентрации лактозы (исходный раствор лактозы - 5%)
Время измерения, сут Значения Фермент, иммобилизованный на носителях: лавсан асбест опилки
1 M±m %
Р 3,57±0,008
71,11
<0,0013,18±0,008
63,34
<0,0012,88±0,012
57,37
<0,001
2 M±m %
Р 3,48±0,012
63,92
<0,0013,29±0,016
65,53
<0,0013,02±0,021
60,15
<0,001
3 M±m %
Р 3,59±0,01
71,51
<0,0013,36±0,021
66,93
<0,0013,07±0,04
61,15
<0,001
5 M±m %
Р 4,02±0,21
80,07
<0,0013,62±0,012
72,11
<0,0013,87±0,025
77,09
<0,001
7 M±m %
Р 4,42±0,004
88,04
<0,0013,95±0,004
78,68
<0,0014,72±0,029
94,02
<0,01
10 M±m %
Р 4,90±0,012
97,60
<0,014,27±0,037
85,05
<0,05---
15 M±m %
Р ---4,57±0,037
91,03
<0,05---
% - процент падения относительно контроля (5,02% раствор лактозы);
Р - достоверность относительно контроля.
Выводы. При иммобилизации ?-галактозидазы на лавсане фермент дает максимальное снижение лактозы в первые трое суток (концентрация лактозы снизилась на 28,9; 36 и 28,5% соответственно через 1,2 и 3 суток). Затем активность фермента снижается, и через 10 суток концентрация лактозы после ферментативного гидролиза снизилась на 2,5%. Можно отметить, что снижение активности составляет в среднем 8,17% за сутки. ?-галактозидаза, иммобилизованная на асбесте, дала большее снижение лактозы, чем иммобилизованная на лавсане. За первые трое суток концентрация снизилась на 36,7; 34,5 и 33% соответственно. Фермент, иммобилизованный на асбесте, дольше сохраняет свою активность: через 15 суток с начала опыта концентрация лактозы составляет 91% от контроля (с 5,02 упала до 4,57%). Снижение активности составляет 4,28% в сутки.
Иммобилизованный на опилках фермент показал максимальное снижение концентрации лактозы: через 1 сутки - на 42,6; через 2-е - 39,9; через 3-е - 38,9%. Однако галактаза сохраняет свою активность меньше времени, чем иммобилизованная на других носителях. Через 7 суток фермент показал снижение лактозы на 6%. Среднесуточное снижение активности - 9,16%.
Итак, иммобилизованный на асбесте фермент показал не только значительное снижение лактозы, но и сохранил свою активность дольше, чем на других носителях.
Таблица 2.15 - Продолжительность действия 0,03% иммобилизованной ?-галактозидазы на снижение концентрации лактозы
Время измерения, сут Значения Фермент, иммобилизованный на носителях: лавсан асбест опилки
1 M±m %
Р 2,81±0,012
55,95
<0,0012,91±0,037
57,96
<0,0012,03±0,025
40,43
<0,001
2 M±m %
Р 2,28±0,016
45,41
<0,0012,82±0,033
56,17
<0,0012,11±0,008
42,03
<0,001
3 M±m %
Р 2,69±0,021
53,58
<0,0013,01±0,012
59,96
<0,0012,12±0,428
42,23
<0,001
5 M±m %
Р 3,17±0,025
63,14
<0,0013,13±0,462
62,35
<0,052,75±0,029
54,78
<0,001
7 M±m %
Р 3,64±0,033
75,69
<0,0013,32±0,016
66,13
<0,0013,60±0,021
71,71
<0,01
10 M±m %
Р 4,15±0,012
82,66
<0,0013,75±0,504
74,70
>0,054,64±0,025
92,43
<0,001
15 M±m %
Р 4,77±0,042
95,01
<0,054,57±0,037
91,03
<0,05---
% - процент падения относительно контроля (5,02% раствор лактозы);
Р - достоверность относительно контроля.
Рисунок 2.2 - Продолжительность действия 0,03% иммобилизованной ?-галактозидазы на снижение концентрации лактозы (исходный раствор лактозы - 5%)
Выводы. 0,03% раствор ?-галактозидазы, иммобилизованный на различных носителях, более эффективно снижает концентрацию лактозы, чем 0,01%. ?-галактозидаза, иммобилизованная на лавсане, дала снижение концентрации в ее растворе на 44% за 1-е сутки; на 44,6% - за 2-е сутки и на 46,4% за 3-и сутки. Затем активность фермента стала уменьшаться примерно на 8,23% в сутки; и через 15 суток концентрация лактозы после гидролиза составила 95% от контроля (4,77 от 5,02%).
При гидролизе ферментом, иммобилизованным на асбесте, концентрация лактозы через 1 сутки снизилась на 42% по сравнению с контролем; через 2 суток - на 43,83%, а через 3 суток - на 40%. После активность фермента снижается в среднем на 5,24%. Через 15 суток концентрация лактозы снизилась с 5,02 до 4,31% и составила 85,85% от контроля.
Фермент, иммобилизованный на древесных опилках, при гидролизе проявил наибольшую эффективность: через 1 сутки концентрация лактозы упала на 69%, через 2 суток - на 58%, через 3 суток - на 57,8%. Однако активность иммобилизованной на опилках ?-галактозидазы ниже, чем на других носителях. Активность снижается в среднем на 10,4% в сутки. Через 10 дней концентрация лактозы снижается лишь на 8% (с 5,02 до 4,64%).
Определить снижение содержание лактозы после ферментативного гидролиза иммобилизованным ферментом в 2-х концентрациях: а) для цельного молока;
В 4 колбы вносили по 100мл свежего коровьего молока 2,5% жирности производства ОАО “Энгельсский Молочный Комбинат”. 1 колба - контроль - молоко без добавления фермента, а в остальные вносили по 10г носителя с предварительно иммобилизованным ферментом. Концентрация лактозы определялась рефрактометрическим методом через 3,6 и 24 часа. Результаты эксперимента представлены в таблицах 2.16 и 2.17.
Таблица 2.16 - Изменение содержания лактозы в коровьем молоке под влиянием 0,01% иммобилизованной ?-галактозидазы
Время измерения, ч Значения Контроль Фермент, иммобилизованный на носителях: лавсан асбест опилки
3 M±m %
Р 4,72±0,13
3,91±0,008
77,88
<0,0013,65±0,037
72,70
<0,053,52±0,008
70,11
<0,05
6 M±m %
Р 4,56±0,49
3,59±0,037
71,51
<0,053,43±0,004
68,32
<0,053,30±0,023
65,73
<0,05
24 M±m %
Р 4,49±0,09
3,27±0,025
65,13
<0,053,21±0,031
63,94
<0,053,15±0,420
62,74
>0,05
% - процент падения относительно контроля (свежее коровье молоко без добавления фермента);
Р - достоверность относительно контроля.
Таблица 2.17 - Изменение содержания лактозы в коровьем молоке под влиянием 0,03% иммобилизованной ?-галактозидазы
Время измерения, ч Значения Контроль Фермент, иммобилизованный на носителях: лавсан асбест опилки
3 M±m %
Р 4,72±0,13
3,72±0,037
74,10
<0,053,44±0,004
68,52
<0,053,28±0,546
65,33
>0,05
6 M±m %
Р 4,56±0,11
3,43±0,004
68,32
<0,053,27±0,504
65,13
>0,053,05±0,029
60,75
<0,05
24 M±m %
Р 4,49±0,09
3,01±0,021
59,99
<0,053,21±0,031
60,75
<0,052,72±0,037
54,18
<0,01
% - процент падения относительно контроля (свежее коровье молоко без добавления фермента);
Р - достоверность относительно контроля.
Рисунок 2.3 - Изменение содержания лактозы в коровьем молоке под влиянием 0,03% раствора ??галактозидазы
Выводы. В свежем коровьем молоке содержание лактозы находится в пределах норм и с течением времени изменяется незначительно (с 4,77 до 4,49%). При добавлении 0,01% ?-галактозидазы, иммобилизованной на лавсане, концентрация лактозы снизилась за сутки на 34,9%, на асбесте - на 36%, а на опилках - на 37,2%.
При добавлении 0,03% ?-галактозидазы, иммобилизованной на различных носителях, концентрация снизилась более значительно. При ферментативном гидролизе иммобилизованном на лавсане ферментом концентрация снизилась через 3 часа на 25,9; 6 часов - 31,7; 24 часа - на 40%. При иммобилизации на асбесте на 31,5; 34,5 и 39,3% через 3,6 и 24 часа соответственно. Максимального снижения концентрации удалось добиться путем гидролиза с помощью ?-галактозидазы, иммобилизованной на опилках: через 3 часа концентрация снизилась на 34,7; через 6сачов - на 39,3, а через 24 часа - на 45,6%. б) для сухого молока.
Аналогичный опыт повторяли с сухим молоком.
Данные результатов опыта по введению иммобилизованной ?-галактозидазы в сухое молоко представлены в таблицах 2.18 и 2.19.
Таблица 2.18 - Изменение содержания лактозы в сухом молоке под влиянием 0,01% иммобилизованной ?-галактозидазы
Время измерения, ч Значения Контроль Фермент, иммобилизованный на носителях: лавсан асбест опилки
3 M±m %
Р 4,68±0,04
4,12±0,042
82,07
>0,054,03±0,012
80,27
<0,053,97±0,008
79,08
<0,01
6 M±m %
Р 4,55±0,14
3,66±0,008
72,90
<0,053,54±0,042
70,51
<0,053,45±0,029
68,72
<0,05
24 M±m %
Р 4,42±0,21
3,28±0,016
65,33
<0,013,22±0,025
64,14
<0,013,09±0,033
61,55
<0,001
% - процент падения относительно контроля (сухое молоко без добавления фермента);
Р - достоверность относительно контроля.
Таблица 2.19 - Изменение содержания лактозы в сухом молоке под влиянием 0,03% иммобилизованной ?-галактозидазы
Время измерения, ч Значения Контроль Фермент, иммобилизованный на носителях: лавсан асбест опилки
3 M±m %
Р 4,68±0,04
3,50±0,042
69,72
<0,013,42±0,042
68,12
<0,053,35±0,016
66,73
<0,01
6 M±m %
Р 4,55±0,14
3,01±0,462
59,96
<0,052,83±0,021
56,37
<0,0012,68±0,546
53,38
<0,05
24 M±m %
Р 4,42±0,21
2,48±0,037
49,40
<0,0012,41±0,029
48,00
<0,0012,27±0,012
45,21
<0,001
% - процент падения относительно контроля (сухое молоко без добавления фермента);
Р - достоверность относительно контроля.
Выводы. В сухом молоке без проведенного гидролиза концентрация лактозы за 24 часа изменяется незначительно: с 4,69 до 4,42%.
При внесении в сухое молоко 0,01% ?-галактозидазы, иммобилизованной на лавсане, концентрация лактозы падает по сравнению с контролем: за 3 часа - на 18%; 6 часов - на 21%, а за 24 часа - на 34,7%. При добавлении такой же концентрации фермента, иммобилизованного на асбесте, концентрация лактозы снижается почти аналогично: на 19,8; 29,5 и 35,9% соответственно за 3,6 и 24 часа. Иммобилизованный на опилках фермент снижает концентрацию лактозы в сухом молоке на 21; 31,3 и 28,5% .
Добавление в сухое молоко 0,03% иммобилизованной ?-галактозидахы дает более выраженное снижение концентрации лактозы. При внесении иммобилизованного на лавсане фермента содержание лактозы снизилось на 30,3; 40,0 и 50,6% за 3,6 и 24 часа; на асбесте - на 31,9; 43,7 и 52,0%. Наибольшую эффективность показал фермент, иммобилизованный на опилках: за 3,6 и 24 часа концентрация лактозы упала на 33,3; 46,6 и 54,8%.
5. Внесение иммобилизованной ?-галактозидазы в сгущенное молоко: а) на стадии полуфабриката внести иммобилизованный фермент; провести ферментативный гидролиз и определить содержание лактозы в вареном сгущенном молоке
Подготовить иммобилизованный фермент. В колбы вносили по 100мл сгущенного молока “Семь гномов” (молоко взяли во время производства на ООО “Маслосырбаза “Энгельсская” до проведения гидролиза). В колбы прибавили по 10г ?-галактозидазы, иммобилизованной на лавсане, асбесте и опилках. Провели ферментативный гидролиз с выдержкой в термостате 3ч при температуре 38?C. Для извлечения иммобилизованного фермента к сгущенному молоку приливали воду в соотношении 1:1, извлекали из жидкого сгущенного молока носитель с ферментом. После этого проводили варку сгущенного молока до готовности, постоянно перемешивая.
Определение концентрации лактозы в сгущенном молоке после гидролиза иммобилизованным ферментом осуществляли фотоколориметрическим методом. Результаты опыта - в таблице 2.20: Таблица 2.20 - Эффективность снижения лактозы в вареном сгущенном молоке “Семь гномов” под влиянием иммобилизованной ?-галактозидазы
Группа Фермент, иммобилизованный на носителях: лавсан асбест опилки
1 %
Р 1,87±0,033
46,75
<0,0011,82±0,42
45,50
<0,051,70±0,025
42,40
<0,001
3 %
Р 1,41±0,021
35,25
<0,0011,28±0,008
42,00
<0,0011,12±0,462
28,00
<0,01
1 - 0,01% концентрация ?-галактозидазы;
3 - 0,03% концентрация ?-галактозидазы;
% - процент падения относительно контроля (вареное сгущенное молоко “Семь гномов” без добавления иммобилизованного фермента(4,00±0,10);
Р - достоверность относительно контроля. б) определение концентрации лактозы в вареном сгущенном молоке, приготовленном на молоке с гидролизованной лактозой.
В этом эксперименте в домашних условиях повторили технологию получения вареного сгущенного молока на ООО “Маслосырбаза “Энгельсская”. Восстановили сухое молоко с водой. Затем в кастрюльки с молоком добавляли по 50г носителя с предварительно иммобилизованным ферментом и проводили гидролиз 3 ч. Извлекали носитель и продолжали приготовление молока: нагрели до 75?C, внесли масло сливочное “Покровское”, дали вработаться 20минут. Затем добавили сахар, после этого нагрели до 95?C и начали варку. В этом случае продолжительность варки сгущенного молока сокращается, так как не требуется охлаждение молока до 38?C для осуществления гидролиза, а затем повторного его нагревания до той же температуры. Для 500г молока потребовалось: - молока сухого - 115г;
- воды - 140мл;
- масла сливочного - 40,5г;
- сахарного песка - 220г.
Статистически обработанные данные эксперимента представлены в таблице 2.21:
Таблица 2.21 - Эффективность снижения лактозы в вареном сгущенном молоке “Семь гномов”, приготовленном на предварительно гидролизованном ?-галактозидазой сухом молоке
Группа Фермент, иммобилизованный на носителях: лавсан асбест опилки
1 %
Р 2,05±0,042
51,25
<0,0012,01±0,016
50,25
<0,011,96±0,546
49,00
<0,05
3 %
Р 1,61±0,037
40,25
<0,0011,53±0,036
38,25
<0,011,38±0,029
34,50
<0,01
1 - 0,01% концентрация ?-галактозидазы;
3 - 0,03% концентрация ?-галактозидазы;
% - процент падения относительно контроля (вареное сгущенное молоко “Семь гномов” без добавления иммобилизованного фермента(4,00±0,10);
Р - достоверность относительно контроля.
Рисунок 2.4 - Эффективность снижения лактозы в вареном сгущенном молоке “Семь гномов”, приготовленном на предварительно гидролизованном ??галактозидазой сухом молоке
Выводы: После внесения 0,01% иммобилизованного фермента в полуфабрикат сгущенного молока, проведения ферментативного гидролиза и варки, концентрация лактозы изменилась следующим образом. При иммобилизации на лавсане снизилась на 53,3%; на асбесте - на 54,5%; на опилках - на 57,5%. При 0,03% ?-галактозидазе, иммобилизованной на лавсане, асбесте и опилках, концентрация лактозы снизилась соответственно на 64,8; 58 и 72%.
В вареном сгущенном молоке, приготовленном на предварительно гидролизированном сухом молоке, также удалось добиться существенного снижения концентрации лактозы. При 0,01% ?-галактозидазе, иммобилизованной на лавсане снижение составило 48,8%, на асбесте - 49,8%, опилках - 51%. После внесения 0,03% фермента, иммобилизованного на лавсане, асбесте и опилках, содержание лактозы снизилось на 59,8; 61,8 и 65,5% соответственно.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
