Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения - Автореферат

В настоящее время во всем мире растет интерес к природным соединениям, меченным стабильными изотопами, в частности дейтерием 2Н (D) и углеродом |3С, которые незаменимы для разнопрофильных биохимических и диагностических целей, структурно-функциональных исследований, а также для изучения клеточного метаболизма разнообразных биологически активных соединений (БАС) с использованием стабильных изотопов. Ими являлись генетически маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к различным таксономическим родам микроорганизмов: факультативные метилотрофные бактерии Brevibacterium meihylicurn, облигатные метилотрофные бактерии Methylobactllusflagettatum, галофильные бактерии Halobacterium halobium и бациллы Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens. Поскольку биосинтетический потенциал исследуемых штаммов за счет конверсии тяжелой воды к началу проведения данной работы был изучен недостаточно, представляло интерес исследование принципиальной возможности их адаптации к росту на средах содержащих тяжелую воду для синтеза меченных целевых продуктов. Для этого были применены специальные биотехнологические подходы по получению меченных БАС, что позволило подойти к реализации комплексного использования химических компонентов биомассы полученных штаммов-продуцентов и созданию новых безотходных микробиологических производств по получению изотопно-меченных БАС на их основе. Разработаны методы получения изотопно-меченных БАС, основанные на использовании высокоактивных штаммов-продуцентов, адаптированных к росту и биосинтезу на средах с высокими концентрациями тяжелой воды.В связи с важностью препаративного аспекта получения дейтерий-меченных соединений в рамках данной работы была изучена возможность адаптации различных штаммов-продуцентов БАС к росту на средах с максимальными концентрациями тяжелой воды (D2O). Для этого были проверены представители различных таксономических групп метилотрофных бактерий, имеющихся в коллекции ГОСНИИ Генетики: L-лейцин-продуцирующий штамм облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum (ileu), реализующий 2-кего-3-дезокси-6-фосфогдюконат-альдолазный (КДФГ) вариант рибуле"зо-5-монофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции углерода и L-фенилаланин-продуцирующий штамм факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum (leu), ассимилирующий метанол по РМФ-циклу. Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации тяжелой воды в ростовых средах, так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к тяжелой воде будет оказывать благоприятный эффект на скорость роста культуры. При этом штамм М. flagellatum обнаружил повышенную чувствительность к тяжелой воде: ингибирование роста бактерий наблюдалось при концентрациях D2О в среде 74,5 об.%. В связи с этим, в экспериментах по изучению уровней включения дейтерия в аминокислоты использовали препараты культуральной жидкости и биомассы М. flagellatum, полученные со среды, содержащей 74,5 об.% тяжелой воды.Как видно из таблицы I, на средах, содержащих тяжелую воду и изотопные аналоги метанола - дейтерометанол CD3OD и 13С-метанол 13CH3OH, выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,5 об.% тяжелой водой выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали обычную воду и метанол СНЗОН (табл. Как видно, способность к росту у М. flagellatum сохранялась лишь в среде, содержащей 74,5 об.% тяжелой воды. Данные по росту исходного и адаптированного к тяжелой воде штамма В. methylicum и максимальному уровню накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости на минимальных средах с добавкой 2 об.% метанола и его дейтерированного аналога СН3ОН/CD3OD, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжелой воды, представлены в таблице 2. С увеличением концентрации тяжелой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64,4 ч на средах с 98 об.% тяжелой водой и 2 об.% CD3OD (табл. Важно то, что выход микробной биомассы и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости при росте адаптированного к тяжелой воде штамма В. inethylicum в полностью дейтерированной среде изменяются по сравнению с контрольными условиями на 12,8% и 5% соответственно (табл.В качестве другой модельной системы для введения стабильной изотопной метки в белки, использовали бактериородопсин (BR), синтезируемый в клеточной мембране H. halobium ET 1QOL (рис.6). Для включения дейтериевой метки в BR использовали два принципиально отличных подхода: сайт-специфическое введение отдельных аминокислот: L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D5]-Trp в BR и униформное мечение бактериородопсина дейтерием путем выращивания П. halobium ET 1001 на среде, содержащей 99,9 ат.% тяжелую воду и дейтеро-гидролизаты В. methylicum. Бактериородопсин выделяли из пурпурных мембран Н. halobium ET 1001 солюбилизацией в 0,5 %-ном растворе додецилсульфата натрия (ДСН) с последующим осаждением белка метанолом. DCI (3 масс.% фенола, в тяжелой воде